1、目的：對(duì)kinectin蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)克隆肝癌相關(guān)抗原Kinectin基因片斷(2089-2367bp)，并進(jìn)行原核表達(dá)和初步純化，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。 方法：(1)利用Vector NTI軟件及互聯(lián)網(wǎng)上蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)軟件等對(duì)人kinectin蛋白序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析；(2)提取人肝癌總RNA，逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，根據(jù)GenBank公布的Kinectin基因cDNA序列(登錄號(hào)222551)設(shè)計(jì)引物，利用RT-P

2、CR法擴(kuò)增出人Kinectin基因片斷(編號(hào)1-8a)，將基因片斷插入原核表達(dá)載體pMAL-C2中，將重組質(zhì)粒pMAL-C2/kinectinl-8a轉(zhuǎn)化DH5a菌，通過(guò)藍(lán)白斑篩選、PCR鑒定及DNA測(cè)序篩出正確的重組子，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta進(jìn)行表達(dá)，采用不同的IPTG加入時(shí)機(jī)及加入濃度、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并通過(guò)SDS-PAGE電泳鑒定，以找出最適誘導(dǎo)條件，將按優(yōu)化條件誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白過(guò)Amylose-re

3、sin親和層析柱純化，factor Xa蛋白酶酶切，獲得純化的kinectinl-8a蛋白，送蛋白質(zhì)串聯(lián)質(zhì)譜分析鑒定。 結(jié)果：(1)人 kinectin蛋白生物信息學(xué)分析結(jié)果表明：①kinectin蛋白分子量約156KD，等電點(diǎn)5.52，N端具有高疏水性，疏水區(qū)位于分子的內(nèi)部；②選擇5個(gè)哺乳動(dòng)物類不同物種的kinectin氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，分析表明：人與其他物種的同源性從高到低依次是狐(93.5％)、牛(92.6％)、馬

4、(92.5％)、小鼠(83.3％)、褐鼠(64.4％);③kinectin的二級(jí)結(jié)構(gòu)以α螺旋為主，有一個(gè)跨膜螺旋(第9～29AA)，一個(gè)跨膜區(qū)，此外還存在一個(gè)信號(hào)肽；④kinectin蛋白序列上具有較多糖基化、磷酸化位點(diǎn)，結(jié)構(gòu)域主要位于2～699，776～899，923～1319氨基酸位置；⑤存在較多T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位。 (2)目的基因正確插入載體pMAL-C2質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)，并成功誘導(dǎo)表達(dá)出MBP-kinectinl-8

5、a融合蛋白；確定了pMAL-C2/kinectinl-8a體外表達(dá)的優(yōu)化條件：37℃振蕩培養(yǎng)3個(gè)小時(shí)后，加入終濃度為0.3mmol/L的IPTG，繼續(xù)在30℃振蕩培養(yǎng)4小時(shí)，可獲得較優(yōu)表達(dá)效果；蛋白質(zhì)飛行質(zhì)譜儀分析所得的肽段與目的蛋白相符。 結(jié)論：(1)利用生物信息學(xué)分析軟件預(yù)測(cè)了kinectin蛋白的結(jié)構(gòu)域、功能域及抗原性，顯示kinectin具有較強(qiáng)的免疫原性和較多的表位；(2)表位預(yù)測(cè)1-8a片段存在一個(gè)得分較高的T細(xì)胞表