1、沙塵暴(sand dust,SD)是中國北方較為常見的一種災害性天氣現(xiàn)象,近年來沙塵暴的發(fā)生頻率越來越高并且波及范圍越來越廣。常發(fā)生在春季的亞洲沙塵暴(ASD)起源于戈壁沙漠、塔克拉瑪干沙漠等中國內(nèi)陸黃土地區(qū),顆粒物向下風向地區(qū)擴散,不僅波及中國東部、朝鮮半島和同本,更遠的可以飄過太平洋最終到達美國,遍及大半個北半球。ASD由于吸附性強,可攜帶多種化學物質(zhì),如來源于大氣污染物(SO2,NO2)的硫酸鹽(SO42-)和硝酸鹽(NO3-),

2、還包括一些微生物,如細菌、真菌、真菌孢子和病毒。近年來,隨著這種生物氣溶膠(生物顆粒)對所波及地區(qū)的生態(tài)系統(tǒng)和人類健康造成嚴重影響,吸附于ASD上的微生物群落引起了廣泛關(guān)注。
　　 亞洲沙塵暴浮塵顆粒物及這些微生物與呼吸系統(tǒng)的健康狀況及迅速增長的發(fā)病率、死亡率有關(guān)。大量的流行病學調(diào)查顯示,在沙塵暴發(fā)生期間,中國的肺炎入院率和韓國首爾的每日死亡率都有增加。有報道稱,在臺灣,沙塵暴發(fā)生與死亡率、心血管疾病的急診處理以及肺炎入院率的增

3、多保持一致。類似的現(xiàn)象在日本也有報道,日本雪杉樹引起的花粉病、季節(jié)性變應(yīng)性鼻炎的惡化以及成人和兒童哮喘的加劇都在沙塵暴發(fā)生期間出現(xiàn)。因此,流行病調(diào)查結(jié)果表明在沙塵暴發(fā)生期間,由微生物和ASD聯(lián)合作用可引起肺炎或過敏性疾病的惡化,需要實驗性的研究來證實流行病調(diào)查的結(jié)果。
　　 我們以前的研究顯示,在OVA刺激的小鼠氣道上皮組織中發(fā)現(xiàn),通過觀察支氣管肺泡灌沈液(bronchoalveolar lavagefluid,BALF)和組織

4、學檢查細胞圖像,野生型ASD可增強過敏性氣道炎癥及杯狀細胞的增殖,同時發(fā)現(xiàn)伴有嗜酸性粒細胞的抗原相關(guān)氣道炎癥加劇了,BALF中促炎癥細胞因子如IL-5、MCP-3、IL-13、嗜酸細胞活化趨化因子和抗原特異抗體的產(chǎn)物(IgE,IgG1)的表達增強。然而,經(jīng)過360℃加熱除去毒性物質(zhì)(如微生物、SO42-、NO3-等)的ASD(heated AsD,H-ASD)卻只造成了輕微的影響,因此沙塵暴顆粒物表面附著物對炎癥加劇起到了重要作用。

5、r>　　 本研究中使用電子加熱器將采集于日本福岡縣北九州市的沙塵暴顆粒的樣本進行加熱處理,以除去吸附于其表面的微生物、SO42-和NO3-等成分。本實驗采用的微生物來自于石川縣珠洲市上空的顆粒表面,共7種微生物,有:Nocardiopsis sp.(No.1-4),Bacillus sP.,Streptmyces sp.和Bjerkandera sp-。本研究應(yīng)用OVA致敏小鼠,采用氣管灌注的方法,分別將加熱處理的ASD(H-ASD)

6、、和加入各種微生物的H-ASD懸浮液注入小鼠氣管內(nèi),觀察小鼠肺組織病理形態(tài)學變化,支氣管肺泡灌洗液(BALF)中炎癥細胞的分布變化,BALF中細胞因子和趨化性細胞因子的蛋白表達改變。從中篩選出一種惡化作用最為強烈的微生物,進行進一步驗證實驗。本研究是關(guān)于沙塵暴顆粒物附著的微生物對OVA誘導哮喘小鼠氣道炎癥作用的研究。
　　 實驗方法：
　　 1、樣本的采集
　　 本研究使用的黃沙在2011年5月1日至3日在日本福

7、岡北九州市折尾地區(qū)的產(chǎn)業(yè)醫(yī)科大學上空采集,由LIDAR(Light Detection And Ranging)檢測這批顆粒物的密度變化為350μg～550μg/m3(結(jié)果來自于日本長崎縣公共健康與環(huán)境科學省)。應(yīng)用圖像分析軟件(OLS3500/SFT-3500,Olympus and Shimadzu)分析顯微圖像得到顆粒的粒徑大小,該方法最低檢出限為1μm,粒徑分布主要在2.8～5.9μm。
　　 2、樣本的處理
　　

8、 分別將采集到的ASD樣本在電子加熱器中經(jīng)過360℃加熱處理30min,以除去吸附于顆粒物表面的微生物、SO42-和NO3-等成分。
　　 3、微生物的分離及獲取
　　 本研究使用的7種微生物是在2008年5月7日日本石川縣珠洲市采集的黃沙顆粒上分離培養(yǎng)的。將采集到的黃沙分別用營養(yǎng)瓊脂、血瓊脂、馬鈴薯葡萄糖瓊脂以及沙保羅培養(yǎng)基培養(yǎng),得到7種微生物。經(jīng)過DNA分析,確定它們分別是Nocardiopsis sp.(No.1

9、-4),Bacillus sp.,Streptomyces sp.和Bjercandera SP.。這些微生物用1%福爾馬林1小時失活,而后以1500rpm離心10min,去掉上清液,余下減壓干燥備用。
　　 4、實驗動物及染毒
　　 從Charles River公司(神奈川,日本)購入5周齡雄性ICR小鼠,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,篩選出體重異常和/或病態(tài)的小鼠,開始實驗。根據(jù)微生物種類的不同將實驗動物分成9個組,每組1-5只

10、不等,各實驗組分別為:卵白蛋白(Ovalbumin,OVA)組,OVA+H-ASD組,OVA+H-ASD+Nocardiopsis sp.(No.1-4),OVA+H-ASD+Bacillus sp.,OVA+H-ASD+Streptomyces sp.和OVA+H-ASD+Biercandera sp.,共29只。每周將小鼠在4%三氟溴氯乙烷作用下麻醉,經(jīng)氣管注入H-ASD(0.1ml/mouse)和OVA(0.1ml/mouse)以

11、及7種失活微生物3.5μg,共投與四次。
　　 在取得實驗結(jié)果之后,選出作用最強的一種微生物,繼續(xù)動物實驗。每間隔一周,將小鼠4%三氟溴氯乙烷作用下麻醉,經(jīng)氣管注入顆粒物(0.1ml/mouse)和/或OVA(0.1ml/mouse)和/或微生物(2μg/mouse或8μg/mouse)。最后一次染毒的第二天,經(jīng)小鼠腹腔注射20%/戊戈巴比妥,將其深度麻醉,用放血法處死。
　　 5、實驗動物的病理檢測
　　 取小

12、鼠肺部固定于10%中性福爾馬林緩沖液中,肺葉分離后,將其切割成2mm厚的碎塊,用石蠟包埋,制成3μm厚的切片。HE染色后觀察呼吸道由近端向遠端嗜酸性粒細胞和淋巴細胞浸潤情況。PAS染色后觀察支氣管上皮杯狀細胞的增殖情況。應(yīng)用顯微鏡對每個切片的呼吸道中炎癥細胞和上皮細胞進行觀察。
　　 6、采集支氣管肺泡灌洗液和血液
　　 小鼠深度麻醉后心臟采血,1500rpm離心10min,取上清液,-80℃的深度冰箱中保存用于檢測血清

13、OVA特異性抗體IgGl和IgE的表達。取小鼠心臟血后,氣管固定,用無菌生理鹽水灌洗小鼠肺部兩次,收集灌洗液后離心。取上清液,-80℃的深度冰箱中保存,用于檢測肺泡灌洗液中細胞因子和趨化因子的蛋白表達。
　　 7、支氣管肺泡灌洗液中的細胞計數(shù)
　　 將肺泡灌洗液離心后得到的沉淀懸浮于生理鹽水中,制成細胞懸液,顯微鏡下應(yīng)用血細胞計數(shù)器直接計數(shù)細胞總數(shù)。細胞懸液應(yīng)用細胞離心涂片機,離心后制成細胞涂片。應(yīng)用Diff-Quik染

14、色后,顯微鏡下觀察計數(shù)中性粒細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞和淋巴細胞。
　　 8、支氣管肺泡灌沈液中的細胞因子和趨化因子的檢測
　　 應(yīng)用酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測BALF中細胞因子和趨化因子的蛋白表達。其中細胞因子包括:白細胞介素(Interleukin,IL)-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-12、IL-13、干擾素(interferon,INF)-γ和腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF-

15、α)、趨化因子包括:嗜酸性粒細胞趨化因子(Eotaxin)、調(diào)節(jié)激活正常T細胞表達和分泌細胞因子(regulated on activation normal T cell expressed and presumably secreted,RANTES)、巨噬細胞炎癥蛋白(macrophage inflammatory protein,MIP)-1α、角化細胞趨化因(Keratinocyte chemoattractant,KC)、單

16、核細胞趨化蛋白(monocyte chemotacticprotein,MCP)-1和MCP-3。
　　 9、OVA特異性IgE和IgG1抗體的檢測
　　 用鼠OVA-IgEELISA試劑盒和鼠OVA-IgG1ELISA試劑盒檢測血清中的OVA特異性IgE和IgG1抗體。
　　 10、統(tǒng)計學分析
　　 本研究應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行分析,統(tǒng)計結(jié)果表述為平均數(shù)±標準差,采用單因素方差分析比較不同染

17、毒組的實驗數(shù)據(jù);當組間差異具有統(tǒng)計學意義時,采用SNK法進行組間比較,p＜0.05具有統(tǒng)計學意義。
　　 實驗結(jié)果：
　　 1、ASD表面成分的檢測結(jié)果
　　 ASD顆粒物的大小主要分布為2.8～5.9μm。ASD顆粒物的各種元素分布為28%Si、7%Al、3.8%Fe、3.2%Ca、1.8%Mg、0.36%Ti、0.10%P、0.091%Mn、0.051%Ba和0.025%Sr。
　　 2、7種微生物對

18、小鼠肺部病理學改變的影響
　　 OVA+H-ASD+Streptmyces sp.與OVA+H-ASD+Bjerkanderasp.組發(fā)現(xiàn),與OVA+H-ASD組相比,小鼠肺呼吸道上皮中的杯狀細胞顯著增殖,特別是Bjerkandera sp.組增生最顯著,小鼠氣管粘膜下嗜酸性粒細胞顯著增多。
　　 3、7種微生物對小鼠支氣管肺泡灌沈液中炎癥細胞分布的影響
　　 OVA+H-ASD+Bierkandera sp.組

19、小鼠BALF中巨噬細胞數(shù)、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和淋巴細胞與OVA組比較顯著增多。
　　 4、7種微生物對小鼠支氣管肺泡灌沈液中細胞因子和趨化性細胞因子表達的影響
　　 Bjerkandera聯(lián)合作用組的KC、MCP-1、RANTES、MCP-3、IL-12水平升高。
　　 5、Bjerkandera sp.對小鼠肺部病理學改變的影響
　　 OVA+H-ASD+B.Sp聯(lián)合作用能引起小鼠肺呼吸道上皮的杯

20、狀細胞重度增殖,且氣管粘膜下嗜酸性粒細胞和淋巴細胞顯著增多,基底膜增厚,呈現(xiàn)玻璃樣變。
　　 6、Bjerkandera sp.對小鼠支氣管肺泡灌洗液中炎癥細胞分布的影響
　　 與OVA+H-ASD相比,OVA+H-ASD+B.sp組小鼠BALF中巨噬細胞的含量增多。與H-ASD+B.sp2和H-ASD+B.sp8組分別比較,OVA+H-ASD+B.sp2/B.sp8聯(lián)合處理進一步導致小鼠BALF中的嗜酸性粒細胞數(shù)增多。

21、
　　 7、Bjerkandera sp.對小鼠支氣管肺泡灌沈液中細胞因子和趨化性細胞因子表達的影響
　　 OVA+H-ASD+B.sp8聯(lián)合作用組中BALF的IL-1β、IL-6、IL-13和TGF-β1明顯高于對照組和OVA單獨作用組,另外,IL-1β、IL-5、IL-13和TGF-β1表達也強于H-ASD單獨作用組。H-ASD+B.sps組的小鼠BALF中Eotaxin、RANTES、KC和MCP-1的水平與對照組

22、及B.sp8單獨處理組相比顯著升高。
　　 8、Bjerkandera sp.對小鼠血清中OVA特異性IgE和IgG1表達的影響
　　 OVA+H-ASD+B.sp8組小鼠血清中OVA特異性IgG1表達比B.sps和H-ASD+B.sp8組的表達增強。在所有組別中未見OVA特異性IgE的表達。
　　 結(jié)論：
　　 1、7種微生物,特別是Bjerkandera sp.,能加劇OVA誘導的哮喘小鼠的氣道炎癥反