1、第一部分脂聯(lián)素基因敲除小鼠動脈鈣化病理特征性觀察
　　 目的：
　　 觀察脂聯(lián)素基因敲除鼠組織病理學(xué)和組織化學(xué)的特性。
　　 方法：
　　 40只6W齡小鼠隨機(jī)分為5組(n＝8)，包括16只脂聯(lián)素基因敲除鼠和野生型鼠24只。分別給予（前4組）高脂高糖膳食飼料和普通膳食，第5組腹腔注射鏈脲菌素1次(30mg/kg)再高脂高糖膳食喂養(yǎng)構(gòu)建2型糖尿病模型鼠。10W后安樂死處死動物，摘眼球取血，分離血漿，采用酶法

2、測定血糖濃度，放射免疫法測定血胰島素水平。分離鼠胸主動脈置4％多聚甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，行茜素紅鈣化染色。分離主動脈弓到髂骨分支的動脈，用比色法測定10％甲酸抽提的鈣含量。超聲破碎胸主動脈，離心后取上清液采用對硝基苯酚法測定ALP活性。用Bradford法測總蛋白含量。Western-blot檢測Runx2蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 高脂高糖膳食喂養(yǎng)條件下，脂聯(lián)素基因敲除鼠與鏈脲菌素干預(yù)鼠的血糖、血胰島素水平

3、明顯高于野生型鼠。敲除鼠出現(xiàn)了嚴(yán)重的動脈鈣化。脂聯(lián)素基因敲除鼠動脈鈣含量明顯高于野生型鼠和鏈脲菌素干預(yù)鼠。與普通膳食身高喂養(yǎng)的小鼠比較，高脂高糖膳食組鼠ALP活性升高，敲除鼠升高更為明顯。Runx2蛋白的表達(dá)脂聯(lián)素基因敲除鼠明顯高于野生鼠。
　　 結(jié)論：
　　 在高脂高糖膳食喂養(yǎng)條件下，脂聯(lián)素基因敲除鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的2型糖尿病性動脈鈣化，其機(jī)制可能與動脈中升高的ALP活性和Runx2蛋白的表達(dá)有關(guān)。
　　 第二部分脂

4、聯(lián)素對鈣化的血管平滑肌的影響
　　 目的：
　　 探討體外培養(yǎng)的鈣化血管平滑肌細(xì)胞中脂聯(lián)素受體的表達(dá)及其用重組脂聯(lián)素干預(yù)后對鈣化血管平滑肌的影響。
　　 方法：
　　 剖殺用高脂高糖飲食喂養(yǎng)10W脂聯(lián)素基因敲除鼠，分離主動脈行鈣化動脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定血管平滑肌細(xì)胞。應(yīng)用PT-PCR和Western-blot分別測定脂聯(lián)素受體mRNA和蛋白在鈣化血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)情況。取不同濃度

5、的(0,3,10,30μg/mL)脂聯(lián)素干預(yù)鈣化的血管平滑肌細(xì)胞48h，采用對硝基苯酚法測定堿性磷酸酶(ALP)活性，放射免疫法檢測骨鈣素(OC)含量，Western-blot檢測Runx2蛋白的表達(dá)。用30μg/mL的脂聯(lián)素干預(yù)20d后，1％茜素紅進(jìn)行鈣化結(jié)節(jié)染色。
　　 結(jié)果：
　　 鈣化血管平滑肌細(xì)胞α-肌動蛋白(α-actin)的免疫細(xì)胞化學(xué)染色證定培養(yǎng)細(xì)胞為血管平滑肌細(xì)胞，且該細(xì)胞能自發(fā)形成鈣化結(jié)節(jié)。鈣化的平滑

6、肌細(xì)胞主要表達(dá)脂聯(lián)素受體R1mRNA和蛋白。脂聯(lián)素干預(yù)能使鈣化的血管平滑肌細(xì)胞ALP活性降低，OC分泌減少，Runx2蛋白表達(dá)下降，并且呈劑量依賴關(guān)系。用30μg/mL脂聯(lián)素干預(yù)20d后，鈣化血管平滑肌細(xì)胞的鈣化結(jié)節(jié)得到顯著抑制。
　　 結(jié)論：
　　 脂聯(lián)素能抑制培養(yǎng)的鈣化血管平滑肌細(xì)胞的鈣化，其機(jī)制可能通過與鈣化血管平滑肌細(xì)胞表達(dá)AdipoR1結(jié)合發(fā)揮作用。
　　 第三部分脂聯(lián)素通過AdpoR1/p38信號途徑

7、抑制CVSMCs體外成骨樣鈣化
　　 目的：
　　 探討脂聯(lián)素抑制脂聯(lián)素基因敲除鼠鈣化血管平滑肌細(xì)胞體外成骨樣鈣化的作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 用30μg/mL脂聯(lián)素干預(yù)鈣化血管平滑肌細(xì)胞，0、5、30、60min后抽提細(xì)胞總蛋白，用Western-blot方法檢測細(xì)胞傳導(dǎo)信號p-JNK、JNK、p-p38、p38、p-ERK、ERK蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。合成脂聯(lián)素受體R1的小干擾RNA(AdipoR1

8、-SiRNAs)抑制AdipoR1表達(dá)，觀察AdipoR1、p-p38和p38蛋白在鈣化血管平滑肌細(xì)胞的表達(dá)。加入p38信號傳導(dǎo)抑制劑SB203580，聯(lián)合AdipoR1-SiRNAs，用對硝基苯酚法測定鈣化血管平滑肌細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)的活性。
　　 結(jié)果：
　　 脂聯(lián)素可誘導(dǎo)鈣化血管平滑肌細(xì)胞p38磷酸化，但對JNK和ERK的激活無作用。SiRNAs-AdipoR1轉(zhuǎn)染可阻斷AdipoR1表達(dá)，可抑制p38磷酸化