1、研究背景： 人口老齡化是廿一世紀人類發(fā)展的主要特征，在我國尤其明顯。根據(jù)新公布的國家人口發(fā)展戰(zhàn)略研究報告表明，二十世紀末，中國60歲以上老年人口占總?cè)丝诘谋壤^10％；2005年底，中國60歲以上老年人口近1.44億，占總?cè)丝诘谋壤_11％；當前，中國老年人口正以年均約3％的速度增長，并將以每10年純增1億老年人口的速度加速老齡化進程。隨著老年人口的增多，我國老年人疾病譜也由相對分散向集中轉(zhuǎn)變，發(fā)病率前五位是高血壓、冠心病、腦

2、血管病、糖尿病、腫瘤。其中以動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)為表現(xiàn)的心腦血管病在老年人群中的高發(fā)病率、高致死率、高致殘率使其成為威脅老年人健康的首要疾病。因此急需開展AS發(fā)病機制及防治對策的研究。 AS發(fā)生的傳統(tǒng)危險因素包括高血壓、高血脂、吸煙、高血糖、年齡以及性別等，以往一直認為年齡屬于AS不可改變的危險因素，因而研究相對較少。隨著人口老齡化的日益發(fā)展，有關(guān)年齡在AS發(fā)生發(fā)展機制的研究逐漸引起重視，并成為防

3、治AS的新靶點。流行病學研究表明年齡是AS發(fā)生與發(fā)展的獨立的危險因素，隨著年齡的增加，促使AS的發(fā)生率顯著升高的一個最具有老年人群特點的原因是血管隨增齡發(fā)生了變化，部分血管細胞發(fā)生了衰老。在老齡人的血管，血管的結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著的改變、血管管腔擴大而彈性降低、血管壁的細胞發(fā)生功能障礙，血管壁基質(zhì)成分也發(fā)生顯著的變化。這些獨立于動脈粥樣硬化之外而發(fā)生的衰老變化改交了各種心腦血管疾病的病理生理機制，從而改變了疾病發(fā)生的閾值、嚴重程度和預(yù)后?，F(xiàn)在越

4、來越多的研究發(fā)現(xiàn)AS血管中的細胞處于衰老狀態(tài)，細胞的衰老可能是AS形成的重要原因已逐漸被廣泛認同?，F(xiàn)在不少老年醫(yī)學的專家甚至建議將抗衰老治療當作治療AS的一項新的治療策略。那么隨著增齡血管為什么會發(fā)生這些變化，血管細胞為什么會衰老，隱藏在血管這些變化后的細胞和分子水平的病理學機制是什么?這種機制是否可為改善或者延緩AS提供重要思路?在人口老齡化日益發(fā)展的現(xiàn)狀下，這已成為AS防治亟需回答的關(guān)鍵問題之一。 對于血管增齡性變化機制的研

5、究首先涉及的是衰老機制問題。目前有關(guān)衰老機制的學說有數(shù)十多種，總體來說最終歸結(jié)為兩大類型：一類是以活性氧簇(Reactiveoxygenspecies，ROS)、糖基化、線粒體受損等損害為代表的環(huán)境傷害衰老理論，另一類是以端?？s短、衰老基因、細胞周期調(diào)控因子等為代表的遺傳因子程序化衰老理論，這兩大類理論從不同角度闡述了機體衰老的可能機制，使衰老的研究不斷向細胞、分子和基因水平深入。在眾多的衰老學說中，自由基一線粒體損傷學說最被廣泛認同。

6、該學說的主旨指發(fā)生在線粒體內(nèi)的惡性循環(huán)促進了衰老的的發(fā)生。該惡性循環(huán)的大體內(nèi)容是(1)線粒體電子傳遞鏈在正常的能量代謝過程中，產(chǎn)生氧自由基；(2)這些產(chǎn)生的氧自由基，對線粒體內(nèi)的磷脂、蛋白質(zhì)、核酸造成氧化損傷；(3)氧自由基對mtDNA的損傷導(dǎo)致mtDNA的突變，從而使線粒體呼吸鏈復(fù)合物的各亞基合成減少，活性下降，功能下降的呼吸鏈復(fù)合物在能量合成的過程將會產(chǎn)生更多的氧自由基副產(chǎn)物；(4)這種惡性循環(huán)將導(dǎo)致更多的mtDNA突變，從而致使衰

7、老以及與衰老相關(guān)的退行性疾病的發(fā)生。 雌激素(E2)是天然的血管保護劑。女性較男性有更低的心血管疾病、腦中風發(fā)生率，并且女性比男性更長壽，雌激素被認為在其中起重要作用，而絕經(jīng)后女性的心血管疾病發(fā)生率明顯上升，進一步證明了這一個論點。所以雌激素的血管保護作用及其作用機制一直受到廣泛的研究，盡管有許多致力于雌激素的心血管保護作用及抗衰老作用機制的研究，但其作用機制還被完全闡明，近年來，隨著線粒體內(nèi)雌激素受體的發(fā)現(xiàn)，人們逐漸將對雌激素

8、的心血管保護作用機制及抗衰老研究焦點轉(zhuǎn)移到其與線粒體之間作用關(guān)系上來。 雌激素的各種生理效應(yīng)是通過其受體ERα和ERβ實現(xiàn)的。ER分布于許多組織，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、泌尿生殖道、胃腸道、骨組織、腎臟、肺臟和子宮。近年來人們在臍靜脈和冠狀動脈的內(nèi)皮細胞上檢測到雌激素受體，為其在心血管的保護作用提供了論理基礎(chǔ)。雌激素通過細胞內(nèi)不同部位的ER產(chǎn)生不同的生理效應(yīng)。首先，雌激素通過胞膜進入胞質(zhì)，與胞質(zhì)ER結(jié)合，形成激素

9、.受體復(fù)合物，最后與DNA片段雌激素反應(yīng)元件結(jié)合，調(diào)節(jié)基因表達。第二，雌激素可通過細胞膜結(jié)合受體發(fā)揮迅速的非基因組效應(yīng)。第三，近年來研究發(fā)現(xiàn)，隨著線粒體上受體的發(fā)現(xiàn)，線粒體被認為是雌激素作用的重要靶標，雌激素有可能是通過核受體和線粒體里的受體協(xié)調(diào)呼吸鏈復(fù)體物蛋白質(zhì)的合成，從而發(fā)揮其心血管保護作用及抗衰老作用。 目的： 因此本文利用活性氧刺激人臍靜脈內(nèi)皮細胞，產(chǎn)生誘導(dǎo)型細胞衰老模型，并觀察雌激素對內(nèi)皮細胞衰老的干預(yù)作用，同

10、時觀察線粒體各項功能指標(細胞色素C氧化酶活性，ATP水平)及線粒體結(jié)構(gòu)，并測定細胞內(nèi)活性氧水平，以證實雌激素的抗血管內(nèi)皮細胞衰老的作用及證實該作用是通過保護線粒體功能實現(xiàn)的。另外，為了進一步證實其作用是通過ER來實現(xiàn)，我們還用雌激素的特異性受體阻滯劑ICI182780對雌激素的作用進行干預(yù)，觀察ICI182780能否阻斷雌激素的以上保護作用。 方法： 1.購買人臍靜脈內(nèi)皮細胞進行傳代，采用3-6代細胞使用60μmol/

11、L過氧化氫(H2O2)作用內(nèi)皮細胞72h產(chǎn)生誘導(dǎo)型細胞衰老模型。 2.將細胞分成四組(1)A組：不含任何刺激；(2)B組：用含60μmol/LH2O2的完全培養(yǎng)液作用細胞72h；(3)C組：在B組基礎(chǔ)上，在H2O2刺激前1h先用0.1μmol/L17β-雌二醇刺激；(4)D組：在C組基礎(chǔ)上，在17β-雌二醇刺激前30min先用10μmol/L的ICI182780刺激。細胞染色法檢測各組細胞的β-半乳糖苷酶表達情況。 3.

12、采取上述分組，每組5例，使用β-半乳糖苷酶染色，在普通光鏡下數(shù)各組細胞染色陽性率。 4.采取上述分組，每組5例，收集細胞，分離線粒體并用BCA法測定線粒體內(nèi)蛋白濃度。 5.將上述各分組的中獲得的線粒體樣品進行線粒體細胞色素C氧化酶活性的測定。 6.采取上述分組，每組5例，收集細胞進行細胞內(nèi)ATP水平的測定。 7.采取上述分組，每組7例細胞完成刺激后用DCFH-DA探針檢測細胞內(nèi)活性氧水平8采取上述分組，收

13、集細胞進行常規(guī)標本處理在電鏡下觀察細胞線粒體形態(tài)。統(tǒng)計處理實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差表示，數(shù)據(jù)處理采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件，各組間比較采用單因素方差分析(One-WayANOVA)，多重比較采用LSD檢驗。P<0.05(雙側(cè))表示差異有顯著性。 結(jié)果： 1.各組SA-β-半乳糖苷酶(SA-β-galactosidase)染色陽性率比較四組細胞染色陽性率具有統(tǒng)計學差異(采用單向方差分析檢驗，F(xiàn)=308.372P=0.000

14、)，其中。與空白組相比，H2O2刺激組陽性細胞率增多具有顯著性意義(P<0.01)；而17β-雌二醇能干預(yù)H2O2的作用(P<0.01)；而ICI18278即可阻斷17β-雌二醇的保護作用(P<0.01)。 2.各組線粒體細胞色素C氧化酶活性比較單項方差分析顯示各組線粒體細胞色素C氧化酶活性存在顯著差異(F=70.065，P=0.000)。其中，與空白組相比，H2O2能使細胞色素C氧化酶活性下降(P<0.01)；而該下降作用能被

15、17β-雌二醇干預(yù)(P<0.01)；而ICI182780即可阻斷17β-雌二醇的保護作用(P<0.01)。 3.各組細胞內(nèi)ATP水平的比較單項方差分析顯示各組線粒體細胞色素C氧化酶活性存在顯著差異(F=7.605，P=0.002)。其中，與正常對照組相比，H2O2刺激組的細胞內(nèi)ATP水平下降(P<0.01)；但同樣能被17β-雌二醇干預(yù)(P<0.01)；而17β-雌二醇的保護作用也被ICI182780阻斷(P<0.05)。

16、 4.各組細胞內(nèi)活性氧水平的比較各組細胞內(nèi)ROS水平存在顯著差異(采用單向方差分析檢驗，F(xiàn)=16.345，P=0.000)。其中，與空白組相比，H2O2刺激組的細胞內(nèi)活性氧水平顯著上升(P<0.01)；而17β-雌二醇能干預(yù)細胞內(nèi)活性氧水平的上升(P<0.01)；而17β-雌二醇+ICI182780組可使細胞內(nèi)活性氧水平再度下降(P<0.01)。 5.各組細胞線粒體形態(tài)比較與空白組比較，H2O2刺激組使細胞線粒體受損，表現(xiàn)為線

17、粒體數(shù)目少，線粒體肥大，畸形較多，嵴腫脹；而17β-雌二醇組上述變化明顯減輕，線粒體形態(tài)與空白組基本一致；ICI182780組的細胞內(nèi)線粒體變化與H2O2刺激組基本一致。 結(jié)論： 1.60μmol/LH2O2作用72h能夠誘導(dǎo)HUVEC發(fā)生提前衰老。 2.E2能夠抑制活性氧誘導(dǎo)的早衰HUVEC的β-半乳糖苷酶的表達。 3.E2能夠保護線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅳ的活性。 4.E2能夠使線粒體的能量合成增加