1、目的：染色體數(shù)目異常是人類染色體疾病的重要類型，經(jīng)常導致胚胎丟失、胎兒流產(chǎn)、嬰兒死亡、先天畸形和神經(jīng)發(fā)育異常等出生缺陷。引物原位標記技術同時結合了FISH和PCR技術的優(yōu)勢，已經(jīng)成為替代FISH的一項技術用于染色體數(shù)目異常的檢測。自引物原位標記技術廣泛引入人類基因組研究和臨床染色體檢查以來，特異染色體引物的設計和評估主要基于特定染色體alpha衛(wèi)星重復序列單元的克隆信息。至2001年，人類基因圖譜的繪制完成，人們可以方便的在互聯(lián)網(wǎng)上任意

2、調(diào)取人類的全基因組序列，并通過新的計算機一互聯(lián)網(wǎng)工具，快速準確地分析DNA序列和比對整個基因組序列，設計和驗證引物。今天人們可以用更新更完整的基因組信息和技術回顧傳統(tǒng)的引物序列，對其有效性和可靠性進行重新的評估。本文試圖用新的基因組工具檢驗和完善非ddNTP阻斷的多色引物原位標記技術，探索一種更為合理的多色PRINS系統(tǒng)程序，并針對精子染色體異倍性的研究進行可靠性分析。 方法：首先我們將傳統(tǒng)引物都與最新的人類基因組信息進行了比對

3、。BLAST比對結果在大多數(shù)情況下驗證了這些經(jīng)典引物的退火有效性。隨后在人類外周血淋巴細胞中建立了一個穩(wěn)定的多色PRINS標記方法并評估其標記效率。通過雙色PRINS預實驗，分析不同的靶標序列和熒光色素的標記特點以確定PRINS標記順序；隨后，采用非ddNTP阻斷的三色PRINS方法，對外周血中期淋巴細胞的18號，21號，X和Y染色體構建了更為穩(wěn)定的多色標記體系。同時，一個克氏綜合征(47，XXY)的特殊外周血樣本用來證明信號與染色體的

4、數(shù)目匹配性，評估多色PRINS方法應用于染色體數(shù)目異?？焖僭\斷的可行性。根據(jù)相關文獻，PRINS技術應該比FISH更適于精子核的標記。本文精子實驗中，在PRINS反應之前，我們采用3M NaOH溶液進行4-5分鐘的預處理，以達到對精子核同時去濃縮和變性的目的。在單色精子PRINS預實驗和雙色淋巴細胞PRINS預實驗的指導下，引物的使用條件(包括濃度和溫度等)以及靶標--dUTP--熒光色素的標記組合使用順序得到了優(yōu)化，最終在外周血淋巴細

5、胞獲得了均一的多色熒光標記信號，反應時間限制在3.5個小時內(nèi)。我們對2份正常男性精液標本的4條染色體(含18號，21號兩條常染色體和X，Y兩條性染色體)進行了分析。 結果：成功地在2.5小時內(nèi)標記了同一精子核內(nèi)的多條染色體，最佳的染色體同時標記通量為3條，單色以上標記率達到99％。對每條染色體的評估都至少分析5000個精子核(性染色體則更多)。精子染色體中常染色體的平均二體率為18號染色體的O.125％到21號染色體的0.152

6、％，性染色體的平均二體率為XX二體的0.085％到XY二染色體的0.102％。與外周血淋巴細胞二色PRINS的檢測結果類似，21號染色體的二體率比其他染色體略高。盡管從結果來看常染色體的二體率比性染色體稍高，但沒有顯著的統(tǒng)計學意義。二倍體率則由0.035％到0.083％浮動，也沒有統(tǒng)計得到顯著的異質(zhì)性(P<0.05)。同時在實驗中觀察到二體率比二倍率要高的情況，這可能意味著在精子形成的減數(shù)分裂過程中，二體更易(或有更多的機會)形成。