1、目的：探索構(gòu)建能表達(dá)人B型利鈉肽(hBNP)的pLenti6/V5-hBNP載體的方法，以實(shí)現(xiàn)hBNP基因在骨骼肌成肌細(xì)胞中長(zhǎng)久、穩(wěn)定的表達(dá)。方法：體外培養(yǎng)SD(SpragueDawley)鼠骨骼肌成肌細(xì)胞，并通過(guò)免疫組織化學(xué)方法鑒定所得細(xì)胞、用臺(tái)酚蘭染色確定培養(yǎng)細(xì)胞的活性并繪制生長(zhǎng)曲線。將目的基因hBNP亞克隆到真核細(xì)胞表達(dá)載體pLenti6/V5-D-TOPO載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pLenti6/V5-hBNP。將pLenti6/V5

2、-hBNP及陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒pLenti6/V5-EGFP分別用lipofectamin2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，獲得病毒顆粒；用病毒顆粒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的SD乳鼠骨骼肌成肌細(xì)胞。熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)確定陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染數(shù)，從而估計(jì)該基因的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率。加入篩選試劑以獲得穩(wěn)定表達(dá)異源B型利鈉肽(BNP)的成肌細(xì)胞。收集瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及篩選后的細(xì)胞培養(yǎng)基，用酶連結(jié)免疫吸附分析(ELISA)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)hBNP的表達(dá)水平。結(jié)果：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法

3、、雙酶切法及DNA測(cè)序顯示hBNP基因成功地插入到pLenti6/V5-D-TOPO載體中；免疫組化顯示此法培養(yǎng)成肌細(xì)胞質(zhì)的純度達(dá)到94％，并且臺(tái)酚蘭染色細(xì)胞的存活率亦達(dá)到了94％以上；陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒的病毒顆粒感染細(xì)胞12h后，在熒光顯微鏡下觀察，其轉(zhuǎn)染效率達(dá)60％以上。檢測(cè)收集的上清，結(jié)果與陰性對(duì)照有顯著差別(P＜0.01)，觀察至第4w，hBNP仍持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了能在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)人B型鈉尿肽的重組質(zhì)粒pLenti