1、前言
　　 長期慢性高砷暴露可發(fā)展為機體多器官腫瘤。皮膚是砷中毒的主要靶器官之一,患者臨床主要表現為掌跖皮膚過度角化、和皮膚色素異常沉著或脫失,病情嚴重者可見砷性Bowen's病或皮膚癌。研究砷對皮膚的損害作用及其可能機制,并尋找針對慢性砷中毒皮膚損害的有效控制和治療手段、降低砷所致皮膚癌的發(fā)病危險等具有重要的理論和現實意義。
　　 大量研究已證實,無機砷暴露能夠導致細胞損傷。亞砷酸鈉(NaAsO2)可使人類角質細胞活力

2、明顯下降,高濃度的As2O3還可抑制正常人類角質細胞(NHK)和人類角質化細胞(HaCaT)的生長。砷還可使細胞周期異常改變,甚至發(fā)生細胞凋亡,以及一些周期相關蛋白的改變。大量研究還證實,氧化應激是砷致細胞毒性作用的重要機制之一。NaAsO2可引起細胞氧化損傷。同時人們也發(fā)現,細胞內ROS的水平對細胞周期調節(jié)具有重要影響。
　　 另一方面,核轉錄因子Nrf2通路的活化是近年來發(fā)現的機體應對化學物和毒物毒性的一種主要的防御反應。N

3、rf2轉位入核與抗氧化反應元件(ARE)結合,調控Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因的轉錄,可維持細胞氧化還原狀態(tài)平衡和降低氧化損傷。研究還發(fā)現,叔丁基對苯二酚(tBHQ)是Nrf2轉位入核的強烈誘導劑,具有極強的細胞保護作用。有關tBHQ拮抗砷毒性作用的研究發(fā)現,tBHQ能夠阻斷砷誘導的一些細胞毒性等損傷。但是目前,tBHQ對砷誘導的角質細胞損傷的可能影響尚未見報道。
　　 據此,本研究擬選用人永生化表皮細胞HaCaT細胞系,觀察tBH

4、Q對無機砷致人皮膚角質細胞細胞毒性、細胞周期和相關調控蛋白改變的拮抗作用、tBHQ對無機砷致角質細胞氧化損傷的拮抗作用以及對細胞內Nrf2信號通路的誘導作用。為尋找針對慢性砷中毒皮膚損害的有效控制和治療手段、減輕砷中毒患者的痛苦和提高生命質量、以及降低砷所致皮膚癌的發(fā)病危險性等提供理論依據和新的線索。
　　 研究方法
　　 1.AlamarBlue還原法測定HaCaT細胞增殖活力
　　 2.倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)

5、改變
　　 3.熒光探針2',7'-二乙酰二氯熒光素檢測細胞內ROS水平
　　 4.流式細胞儀法測定細胞周期
　　 5.硫代巴比妥酸檢測法測定細胞內MDA含量
　　 6.改進的黃嘌呤氧化酶檢測法測定細胞內SOD活性
　　 7.鉬酸銨檢測法測定細胞內CAT活性
　　 8.Westernblot法分析細胞內Nrf2、NQO1、HO-1、CyclinD1和CDK4的蛋白表達水平
　　 9

6、.實時定量PCR法檢測細胞內NQO1和HO-1的mRNA表達水平
　　 結果
　　 1.tBHQ對NaAsO2致HaCaT細胞增殖活力下降、細胞周期阻滯及其調控蛋白異常改變的拮抗作用
　　 NaAsO2單獨作用HaCaT細胞,AlarnarBlue還原率隨染砷濃度的增加而明顯下降,差異具有顯著性(p＜0.01)。而tBHQ預處理后,細胞AlamarBlue還原率與相同濃度NaAsO2單獨作用組相比明顯恢復,且差異

7、具有統(tǒng)計性(p＜0.01)。
　　 NaAsO2單獨作用HaCaT細胞,G0/G1期細胞比例明顯下降(p＜0.01),S期和G2/M期細胞比例較對照組明顯增加(p＜0.01)。tBHQ預處理后,tBHQ(50μmol/L)預處理的NaAsO2(25、50μmol/L)組細胞G0/G1期細胞比例有所上升(p＜0.01);tBHQ(50μmol/L)預處理的NaAsO2(50μmol/L)組S期細胞比例明顯下降(p＜0.01);G2

8、/M期細胞比例整體呈下降趨勢。
　　 NaAsO2單獨作用于HaCaT細胞,細胞周期相關蛋白CyclinD1和CDK4的蛋白表達隨NaAsO2染毒濃度的增加而明顯下降(p＜0.01)。tBHQ預處理后,CyclinD1和CDK4蛋白表達均明顯高于相同濃度NaAsO2單獨作用組(p＜0.01)。
　　 2.tBHQ對NaAsO2致HaCaT細胞氧化損傷的拮抗作用
　　 NaAsO2單獨作用HaCaT細胞,細胞內RO

9、S水平和MDA含量明顯升高,同時SOD和CAT酶活性明顯下降(p＜0.01)。tBHQ預處理后,細胞內ROS水平和MDA含量下降,而SOD和CAT酶活性明顯恢復(p＜0.01)。
　　 3.tBHQ對NaAsO2致HaCaT細胞內Nrf2蛋白、及Nrf2下游調控基因NQO1和HO-1蛋白和mRNA表達的影響
　　 tBHQ單獨作用可長時間持續(xù)誘導HaCaT細胞內Nrf2、NQO1和HO-1的蛋白表達,且均明顯高于對照組(

10、p＜0.01)。
　　 tBHQ預處理再與NaAsO2共同處理,Nrf2、NQO1和HO-1的蛋白表達均明顯高于相同濃度NaAsO2單獨作用組(p＜0.01)。NQO1和HO-1的mRNA表達水平也明顯高于相同濃度NaAsO2單獨作用組(p＜0.01)。
　　 結論
　　 1.tBHQ對無機砷致人皮膚角質細胞的細胞毒性和細胞周期異常變化等具有一定的拮抗作用。
　　 2.tBHQ能夠減輕無機砷致人皮膚角質細