1、第一部分自發(fā)性高血壓大鼠甲羥戊酸途徑關(guān)鍵酶的表達改變與心血管組織重構(gòu)的關(guān)系.
　　 研究背景:
　　 甲羥戊酸途徑是細胞內(nèi)重要的代謝途徑,其合成了固醇類異戊二烯(如膽固醇)和非固醇類異戊二烯中間產(chǎn)物,包括法尼基焦磷酸(famesylpyrophosphate,FPP)和櫳牛兒櫳牛兒焦磷酸(geranylgeranylpyrophosphate,GGPP)。而非固醇類異戊二烯中間產(chǎn)物是小G蛋白翻譯后修飾過程不可或缺的。異戊

2、烯轉(zhuǎn)移酶催化小G蛋白的羧基末端加上法尼基或櫳牛兒櫳牛兒基使之活化。最新研究證明,小G蛋白Ras,Rho家族參與了自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)的心血管組織的重構(gòu)。
　　 目的:
　　 本研究探索在SHR大鼠的不同血壓水平階段,心臟、血管和肝臟中甲羥戊酸途徑關(guān)鍵酶的改變以及其與心血管重構(gòu)的關(guān)聯(lián)性。
　　 方法:
　　 3、16和25周齡的雄性SHR大鼠和Wistar-Kyoto(WKY)大鼠用尾套法檢測收縮壓,

3、用常規(guī)酶法測定血清膽固醇水平,組織學(xué)分析法檢測左心室和胸主動脈肥厚指標。用Western blot法檢測組織(心臟、主動脈和肝臟)中甲羥戊酸途徑關(guān)鍵酶的蛋白表達:HMG—CoA還原酶(HMGR)、法尼基焦磷酸合酶(FDPS)、角鯊烯合成酶(SQS)、法尼基轉(zhuǎn)移酶α亞基(FNTA)、法尼基轉(zhuǎn)移酶β亞基(FNTB)、牻牛兒牻牛兒基轉(zhuǎn)移酶(GGTase-Ⅰ)。
　　 結(jié)果:
　　 3周齡SHR大鼠的血壓與WKY大鼠相似,16周

4、和25周的SHR大鼠血壓隨年齡而增高,且明顯高于WKY大鼠。3周齡的SHR大鼠的低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平明顯低于WKY大鼠,而高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和總膽固醇(STC)水平與WKY大鼠相似。16周和25周SHR大鼠的STC、LDL-C和HDL-C水平都顯著低于WKY大鼠。3周的SHR大鼠已經(jīng)出現(xiàn)一定程度的心室肥厚和血管重構(gòu),而在16周和25周時SHR大鼠與WKY大鼠相比,則形成了更加顯著的差異。SHR大鼠在各周齡的

5、心臟組織中HMGR、FDPS、GGTase-Ⅰ蛋白表達明顯上調(diào),而SQS表達下調(diào)。在SHR大鼠的胸主動脈中,除了與心臟組織HMGR、FDPS、GGTase-Ⅰ和SQS相似的蛋白表達改變外,FNTA在16和25周齡時上調(diào),FNTB在25周齡時上調(diào)。SHR大鼠的肝臟組織中,在各個周齡都表現(xiàn)了HMGR的上調(diào)和SQS的下調(diào)。
　　 結(jié)論:
　　 SHR大鼠的心血管重構(gòu)出現(xiàn)早于血壓的形成和發(fā)展,而其低水平的血清膽固醇濃度可能由于肝

6、臟膽固醇合成分支的關(guān)鍵酶SQS表達的下調(diào)。而在心臟和血管中,甲羥戊酸途徑的非固醇類異戊二烯分支合成途徑中的相關(guān)酶的表達上調(diào),SQS表達的下調(diào)可能誘導(dǎo)了小G蛋白的過度活化,進而導(dǎo)致SHR大鼠的心血管肥厚和重構(gòu)。
　　 第二部分在體法尼基焦磷酸合酶的抑制對自發(fā)性高血壓大鼠內(nèi)皮功能的影響及可能機制一抗氧化應(yīng)激.
　　 研究背景:
　　 法尼基焦磷酸合酶(famesyl pyrophosphate synthase,FD

7、PS)是甲羥戊酸途徑的關(guān)鍵酶之一,既往研究發(fā)現(xiàn):自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)中甲羥戊酸途徑的一些關(guān)鍵酶表達顯著高于正常的Wistar-Kyoto(WKY)大鼠,其中包括FDPS。并且用二膦酸鹽阿侖膦酸鈉抑制FDPS從而改善了SHR大鼠的內(nèi)皮功能障礙,可能機制包括通過抑制FDPS,從而減少類異戊二烯中間產(chǎn)物的產(chǎn)生包括法尼基焦磷酸(famesylpyrophosphate,FPP)和櫳牛兒牻牛兒焦磷酸(geranylgeranylpyroph

8、osphate,GGPP)。進而抑制了小G蛋白的類異戊烯化修飾過程,包括了法尼基化和牻牛兒牻?；鶅夯?而GGPP對于小G蛋白RhoA的牻牛兒牻牛兒基化和活化非常重要。抑制了小G蛋白RhoA的活化,進而上調(diào)內(nèi)皮一氧化氮合酶(eNOS)的表達。
　　 除此,另有大量實驗證明SHR中活性氧族(ROS)終產(chǎn)物顯著增多,SHR的內(nèi)皮功能損傷與過度活躍的氧化應(yīng)激有關(guān),同樣,Racl的活化也依賴于牻牛兒牻牛兒基化,活化的Racl可正向調(diào)節(jié)煙酰

9、胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶的表達和活性,從而調(diào)控ROS終產(chǎn)物。
　　 目的:
　　 本研究主要探索FDPS抑制劑二膦酸鹽伊班膦酸鈉(Ibandronate)能否通過抑制過度氧化應(yīng)激從而改善SHR大鼠的內(nèi)皮功能,并探索可能途徑。
　　 方法:
　　 10周齡雄性SHR大鼠和WKY大鼠用Ibandronate(1mg／kg／day)灌胃處理30天。用離體血管環(huán)灌流技術(shù)檢測內(nèi)皮依賴性和非內(nèi)皮依賴性

10、血管舒張作用,觀察SHR和WKY大鼠的血管環(huán)功能狀況:1.Ibandronate、GGTI-286、C3 exoenzyme、Y-27632、Racl inhibitor或apocynin預(yù)孵30 mins,檢測血管環(huán)功能；2.Ibandronate與GGOH、FOH或MEV共孵2h。以上分別操作后都用AngⅡ進行預(yù)收縮,觀察Ach濃度梯度(10-9 to10-5M)曲線舒張情況。用熒光分析法檢測胸主動脈中活性氧O2-的相對含量和NAD

11、PH氧化酶的活性,pull-down法測定胸主動脈Racl的活性,用Western blot法檢測胸主動脈NADPH氧化酶亞基p47phox的表達水平。
　　 結(jié)果:
　　 Ibandronate能部分改善SHR大鼠受傷的內(nèi)皮依賴性血管舒張作用,其干預(yù)可降低胸主動脈中Racl的活性,下調(diào)NADPH氧化酶亞基p47phox的表達和活性氧ROS的含量。
　　 結(jié)論:
　　 FDPS的抑制劑Ibandronat

12、e可以改善SHR大鼠的內(nèi)皮功能,其機制可能是通過抑制了Racl的活化,下調(diào)NADPH氧化酶的表達、活性進而抑制了過度的氧化應(yīng)激反應(yīng)。
　　 第三部分法尼基焦磷酸合酶在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中的作用.
　　 研究背景:
　　 既往研究證明在血管細胞中,活性氧族(ROS)的產(chǎn)生可被許多體液因子如血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)誘導(dǎo),自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)中過度活躍的氧化應(yīng)激與增高AngⅡ水平

13、有關(guān)。多種血管細胞包括平滑肌細胞參與了AngⅡ誘導(dǎo)的過度氧化應(yīng)激,而且有多種細胞通路參與了AngⅡ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激,其中包括Racl／煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶通路。法尼基焦磷酸合酶(FDPS)能催化合成類異戊二烯中間產(chǎn)物櫳牛兒牻牛兒焦磷酸(geranylgeranylpyrophosphate,GGPP),后者在小G蛋白異戊二烯化過程中是不可或缺的,小G蛋白Racl的異戊二烯化和活化也是必需的。而活化的Racl可正向調(diào)

14、節(jié)NADPH氧化酶的表達和活性,從而調(diào)控ROS終產(chǎn)物。
　　 目的:
　　 本研究主要明確用二膦酸鹽伊班膦酸鈉(Ibandronate)抑制FDPS可否影響SHR大鼠血管平滑肌細胞(VSMCs)在AngⅡ誘導(dǎo)下的氧化應(yīng)激反應(yīng),同時研究該作用是否與Racl、NADPH氧化酶途徑相關(guān)。
　　 方法:
　　 來源于SHR大鼠和WKY大鼠的原代VSMCs用AngⅡ刺激3h,或者在實驗中,VSMCs在AngⅡ刺激前

15、分別先孵育24 h的Ibandronate(10-8 to10-5M)、Ibandronate(10-4M)加牻牛兒牻牛兒醇(GGOH,Geranylgeraniol,3×10-5mol／L)、Ibandronate加法尼醇(FOH,Farnesol,3×10-5mol／L)、Ibandronate加甲羥戊酸(MEV,Mevalonate,10-4 mol／L),GGTI-286(牻兒牻牛兒基轉(zhuǎn)移酶抑制劑,10-5mol／L)或Racl

16、inhibitor(10-4 mol／L)。然后用熒光測定法檢測細胞中的ROS,用試劑盒檢測細胞NADPH氧化酶活性,pull-down法檢測細胞中Racl的活性,用Western blot.檢測NADPH氧化酶關(guān)鍵亞基p47phox的蛋白表達情況和Racl總蛋白表達情況。
　　 結(jié)果:
　　 (1)AngⅡ可濃度依賴性誘導(dǎo)氧化應(yīng)激產(chǎn)物ROS的產(chǎn)生,而SHR大鼠的VSMCs比WKY大鼠在AngⅡ誘導(dǎo)下出現(xiàn)更大的氧化應(yīng)激反

17、應(yīng)。FDPS抑制劑Ibandronate可濃度依賴性抑制AngⅡ誘導(dǎo)的ROS的產(chǎn)生。也抑制了AngⅡ?qū)acl,NADPH oxidase的激活和p47phox的蛋白上調(diào)。
　　 (2)GGOH部分逆轉(zhuǎn)了Ibandronate的抗氧化應(yīng)激反應(yīng),而FOH或MEV沒有逆轉(zhuǎn)作用。
　　 (3)抑制劑GGTI-286、Racl inhibitor可模擬Ibandronate對AngⅡ誘導(dǎo)的過度氧化應(yīng)激反應(yīng)的抑制作用。