1、前言
　　 腦缺血是嚴(yán)重威脅人類健康的高發(fā)的疾病之一,其損傷機(jī)制有興奮性毒性,鈣超載,細(xì)胞凋亡,炎癥,自由基,一氧化氮以及線粒體的損傷。血腦屏障結(jié)構(gòu)破壞和功能的變化是腦缺血早期的重要病理過(guò)程之一,并且是腦缺血早期死亡的主要危險(xiǎn)因素之一。因此,研究腦缺血時(shí)血腦屏障通透性的變化以及可能的保護(hù)機(jī)制對(duì)腦缺血的治療具有重要的意義。
　　 綠茶多酚(green tea polyphenols,GTPs)是綠茶中所含的一類多羥基酚類化

2、合物的總稱,其主要成分是兒茶素類化合物,其中表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)的含量最高,約占兒茶素的80％,被認(rèn)為是綠茶多酚生物活性的主要來(lái)源。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),綠茶多酚具有多方面的藥理作用,如抗氧化、抗焦慮、抗腫瘤、抗輻射損傷、抗炎、降低血糖和血脂作用等,其神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制與金屬螯合,自由基清除,影響細(xì)胞存活和凋亡基因的過(guò)度表達(dá)以及對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,線粒體功能和泛素.蛋白酶體系統(tǒng)的

3、調(diào)節(jié)有關(guān),通過(guò)這些機(jī)制,綠茶多酚對(duì)帕金森病和阿爾茨海默氏癥等神經(jīng)變性疾病具有防治作用。但綠茶多酚對(duì)腦缺血時(shí)血腦屏障通透性的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　 腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞是血腦屏障的重要組成部分,內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)膜表面含有豐富的內(nèi)陷囊狀結(jié)構(gòu),即胞膜窖(caveolae)。物質(zhì)通過(guò)血腦屏障一般有兩種途徑:細(xì)胞旁途徑和跨細(xì)胞途徑。Caveolae介導(dǎo)的內(nèi)化途徑是經(jīng)典的跨細(xì)胞途徑之一,caveolin-1是caveolae的標(biāo)志性蛋白,內(nèi)皮細(xì)胞有可

4、能是通過(guò)ERK1/2和p38MAPK途徑下調(diào)caveolin-1的表達(dá)。本研究通過(guò)給大鼠灌胃服用綠茶多酚,旨在探討綠茶多酚對(duì)腦缺血大鼠血腦屏障通透性的影響和可能的相關(guān)機(jī)制。
　　 材料和方法
　　 一、實(shí)驗(yàn)材料
　　 (一)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　 本研究采用中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的Wistar大鼠,雄性,體重250～300g。
　　 (二)主要試劑
　　 綠茶多酚(杭州禾田生物有限公司)；兔

5、抗大鼠caveolin-1,p-ERK1/2和ERK1/2抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)；小鼠抗大鼠β-actin抗體(武漢博士德試劑公司)；β-actin,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠二次抗體(北京中山公司)；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔二抗(武漢博士德試劑公司)；SP免疫組化試劑盒、DAB顯色劑(福州邁新生物技術(shù)有限公司)；RT-PCR試劑盒(Takara公司)；伊文思藍(lán)(日本Fluka公司)。
　　 (三)主要儀器

6、r>　　 大鼠腦立體定位儀(日本光電株式會(huì)社)；激光多普勒腦血流儀(moorLAB,England)；PCR儀(德國(guó)Biometra公司)；電子分析天平；恒溫水浴箱；低溫冷凍離心機(jī)(Hitachi,Japan)；通用電泳儀(Bio-Rad,USA)；轉(zhuǎn)印儀(北京市六一儀器廠)；-80℃深度冰箱(Toshiba,Japan)；恒溫冷凍切片機(jī)(Leica,GER)。
　　 二、實(shí)驗(yàn)方法
　　 (一)動(dòng)物準(zhǔn)備及分組:

7、　　 實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分成兩組:對(duì)照組和綠茶多酚組,根據(jù)缺血時(shí)間不同,將每組大鼠進(jìn)一步分為:缺血0h組,缺血1h組,缺血2h組及缺血4h組。綠茶多酚組大鼠按400mg/kg灌服綠茶多酚蒸餾水溶液,每日2次,每次1mL,；對(duì)照組給予等體積蒸餾水,自由飲食,活動(dòng)。灌胃30天后,進(jìn)行局灶性腦缺血模型的制作。
　　 (二)大鼠腦缺血模型的制備。
　　 (三)大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分和腦梗死體積的測(cè)定。
　　 (四)應(yīng)用伊文思藍(lán)滲

8、透性評(píng)估血腦屏障通透性的變化。
　　 (五)RT-PCR法檢測(cè)缺血腦組織微血管段caveolin-1的mRNA表達(dá)。
　　 (六)免疫組化法檢測(cè)缺血腦組織微血管內(nèi)皮細(xì)胞caveolin-1的分布和表達(dá)變化。
　　 (七)Wesrern blot法檢測(cè)缺血腦組織微血管段caveolin-1,p-ERK1/2蛋白表達(dá)的變化。
　　 (八)圖象分析
　　 免疫組化結(jié)果用Motic Images Adtv

9、anced 3.2實(shí)時(shí)圖象分析系統(tǒng)采集照片并進(jìn)行定量分析。Western blot結(jié)果用Chemi Imager 5500V 2.03軟件掃描,用Fluor Chen2.0軟件定量分析顯色帶的IDV值。
　　 (九)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 所有數(shù)值均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 討論
　　 在本研究中,預(yù)先對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃服用

10、綠茶多酚溶液,然后建立局灶性腦缺血模型,觀察綠茶多酚對(duì)大鼠腦缺血后血腦屏障通透性變化的影響。發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組缺血0h相比,缺血1h,2h和4h組缺血區(qū)腦組織EB含量顯著增加:綠茶多酚的缺血1h,2h,4h組的EB含量與對(duì)照組缺血同時(shí)點(diǎn)組相比顯著下降,綠茶多酚顯著下調(diào)缺血腦組織微血管段的caveolin-1 mRNA,蛋白水平和p-ERK1/2蛋白表達(dá)。本研究結(jié)果提示,綠茶多酚對(duì)腦缺血時(shí)血腦屏障的通透性具有保護(hù)作用,其機(jī)制可能與血管內(nèi)皮細(xì)胞的

11、caveolin-1 mRNA和蛋白的表達(dá)下調(diào)相關(guān),p-ERK1/2表達(dá)下調(diào)可能與caveolin-1的變化相關(guān)。
　　 腦缺血導(dǎo)致血腦屏障開(kāi)放,已有研究證明綠茶多酚能預(yù)防中風(fēng),可以作為腦缺血后的神經(jīng)保護(hù)因子。目前關(guān)于綠茶多酚的研究主要是對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用。綠茶多酚口服吸收后分布廣泛,也可通過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦組織,減少腦缺血導(dǎo)致的梗死體積和神經(jīng)元損傷。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,EGCG具有顯著的抗氧化功能,可以預(yù)防局部腦缺血造成的神經(jīng)損傷和梗

12、塞,腦缺血再灌注后腦梗死體積明顯降低,依然能顯示抗氧化和預(yù)防神經(jīng)損傷的功能。在本研究中與對(duì)照組相比,綠茶多酚組顯著降低了缺血組增高的血腦屏障通透性,首次證實(shí)綠茶多酚對(duì)缺血時(shí)血腦屏障的通透性具有保護(hù)作用。
　　 Caveolin是caveolae的主要結(jié)構(gòu)成分,在內(nèi)皮細(xì)胞的功能有:跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)作用,入胞作用,調(diào)節(jié)內(nèi)皮組織通透性,致動(dòng)脈粥樣硬化,并參與G-蛋白介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),酪氨酸激酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng),蛋白激酶C和eNOS的信號(hào)通路等,在血

13、腦屏障中具有重要作用,但其作用機(jī)制還不清楚。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellularregulated protein kinases,ERK)包括ERK-1和ERK2,統(tǒng)稱為ERK1/2,磷酸化激活后,可將信號(hào)從表面受體傳至核內(nèi),作用于多種轉(zhuǎn)錄因子,在神經(jīng)系統(tǒng)中ERK1/2調(diào)節(jié)神經(jīng)元分化,可塑性及神經(jīng)元存活,介導(dǎo)了胞外因子的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　 在本研究中,腦缺血后微血管內(nèi)皮細(xì)胞ERK1/2磷酸化水平表達(dá)增加,而綠茶多酚

14、則使ERK1/2活性顯著降低。我們推測(cè)綠茶多酚有可能通過(guò)調(diào)節(jié)NOS活性,進(jìn)而改變內(nèi)皮細(xì)胞caveolin-1的表達(dá)水平,ERK1/2可能是其發(fā)揮作用的重要物質(zhì)之一。
　　 結(jié)論
　　 1、綠茶多酚組顯著降低了腦缺血時(shí)增高的血腦屏障通透性。
　　 2、綠茶多酚顯著降低了腦缺血時(shí)增加的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞caveolin-1的mRNA和蛋白表達(dá),這可能是綠茶多酚對(duì)缺血時(shí)血腦屏障通透性起到保護(hù)作用的機(jī)制之一。