1、剛地弓形蟲是一種屬于頂復(fù)門的細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，呈現(xiàn)世界性分布，能導(dǎo)致人獸共患寄生蟲病的發(fā)生。大多數(shù)人感染弓形蟲時通常沒有癥狀，但在免疫抑制和免疫缺陷個體中，如艾滋病病人、器官移植、長期接受化療的惡性腫瘤患者可能會導(dǎo)致嚴(yán)重的后果。孕婦感染可引起流產(chǎn)、畸胎、死胎和胎兒失明等。動物感染弓形蟲給畜牧業(yè)也帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于目前尚無治療弓形蟲病的特效療法，所以開發(fā)有效的弓形蟲疫苗顯得尤為重要。本研究中我們選取了ROP5和ROP7兩種候選基因以

2、構(gòu)建復(fù)合DNA疫苗。
　　目的:研究目的是探索ROP5/ROP7基因?qū)ALB/c小鼠弓形蟲感染的免疫保護(hù)性。
　　方法:根據(jù)GenBank發(fā)表的弓形蟲ROP5和ROP7序列設(shè)計(jì)合成引物，通過PCR擴(kuò)增獲取ROP5和ROP7基因。采用亞克隆技術(shù)將兩基因分別克隆至真核表達(dá)載體pBudCE4.1，分別構(gòu)建能表達(dá)ROP5和ROP7的重組真核表達(dá)載體pBudCE4.1-ROP5(pROP5), pBudCE4.1-pROP7(pRO

3、P7)和pBudCE4.1-ROP5/ROP7(pROP5/ROP7)，并對它們進(jìn)行酶切鑒定。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293-T細(xì)胞，經(jīng)Western blot分析鑒定后，大量提取重組質(zhì)粒用于免疫小鼠。動物實(shí)驗(yàn)通過ELISA檢測免疫小鼠血清特異IgG水平和細(xì)胞因子并觀察弓形蟲感染小鼠后的存活時間評價其免疫保護(hù)力。
　　結(jié)果:PCR擴(kuò)增出1，650 bp和1，728 bp大小的目的基因片段，ROP5和ROP7兩個基因成功連接到同一個表達(dá)

4、載體pBudCE4.1上并且能在HEK293T細(xì)胞中表達(dá)。Western blot分析，可檢測到ROP5和ROP7蛋白的表達(dá)。復(fù)合基因免疫的小鼠產(chǎn)生了較高水平的血清抗體。在動物試驗(yàn)中，復(fù)合基因疫苗免疫的小鼠生存時間較其它組小鼠顯著延長，復(fù)合基因疫苗免疫小鼠中抗弓形蟲IgG、IgG2a的抗體水平均高于其它組(P＜0.05)。在細(xì)胞因子檢測中，雙基因疫苗免疫的小鼠表現(xiàn)出更高水平的IFN-γ（P＜0.05），而各組間IL-4和IL-10水平無