1、目的：通過基因工程技術，表達梅毒螺旋體（Tp）重組蛋白Tp0463，探討其在梅毒臨床血清學診斷中的價值，為發(fā)現(xiàn) Tp新的候選診斷抗原提供實驗依據(jù)。
　　方法：從Genbank獲取Tp0463蛋白的基因序列，以Tp Nichols標準株的全基因組DNA為模板，PCR擴增該基因編碼第8-110號氨基酸的基因片段；將目的基因克隆入T-A克隆載體pMD18-T中，再亞克隆入原核表達載體pET28a(+)中，構建重組質粒pET28a(+)/

2、Tp0463，經(jīng)PCR、雙酶切與測序鑒定后轉化至表達宿主菌E.coli BL21(DE3)中，IPTG誘導表達蛋白，SDS-PAGE分析目的產物的表達形式，用Ni-NTA親和層析法純化目的重組蛋白，SDS-PAGE分析純化蛋白的純度，BCA法測定純化蛋白濃度；Western blot鑒定表達產物的免疫反應性（抗原性）和特異性。以純化重組蛋白TP0463包被微孔板，建立間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）方法，檢測標準梅毒陽性血清、陰性血清

3、共40份，優(yōu)化ELISA反應條件；以優(yōu)化的ELISA檢測體系隨機檢測臨床診斷明確的梅毒患者血清150份、健康人血清份150份、易發(fā)生交叉反應的人群（類風濕性關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、結核病患者及孕婦）血清40份，與金標準梅毒螺旋體明膠顆粒凝集試驗（TPPA）進行平行比較，初步評價重組抗原Tp0463在梅毒血清學診斷中的應用價值。
　　結果： PCR擴增出一大小約330bp的目的片段（含引物），重組質粒經(jīng)PCR、雙酶切和測序（測序結果

4、與GenBank登錄序列完全一致）鑒定證實插入片段為目的基因Tp0463；SDS-PAGE分析顯示，構建的pET28a(+)/Tp0463原核重組表達菌在IPTG誘導下表達了一相對分子量約為16kDa的重組蛋白，在宿主菌體細胞內主要以可溶性方式存在，經(jīng)Ni-NTA親和純化后，純度在95％以上；Western-blot結果顯示目的蛋白僅能與標準梅毒陽性混合血清發(fā)生特異性反應，而不與非梅毒混合血清反應。以重組蛋白為已知抗原建立間接ELISA

5、法，檢測標準梅毒陽性和陰性血清，其陽、陰性符合率分別為95.45%和100%，總符合率為97.5%；對340份臨床標本隨機進行檢測，與金標準TPPA法比較，建立的ELISA法的總靈敏度為88.7%，低于TPPA法，特異度為100%，兩種方法的總符合率為95.0%。
　　結論：
　　1.成功構建 Tp0463原核表達重組質粒，在宿主菌內誘導高效表達重組目的蛋白，該蛋白有良好的免疫反應性。
　　2.與金標準 TPPA方法相