1、卵巢組織冷凍保存已經成為生殖醫(yī)學領域研究的熱點。凍融后的卵巢組織主要用于移植或體外培養(yǎng)。對于惡性腫瘤患者來說,自體移植顯然是不合適的,而異種移植又受到倫理以及動物源性傳染病的限制。體外培養(yǎng)又分為卵巢組織體外培養(yǎng)和卵泡體外培養(yǎng)。大量動物實驗研究表明,卵巢組織體外培養(yǎng)可以保存完整的卵泡結構以及卵泡與組織間的相互作用,成為探索新鮮或凍融卵巢組織中卵泡生長發(fā)育的重要研究模型。但是,由于人卵巢皮質中卵泡的分布不均勻,僅靠冷凍前的組織形態(tài)學分析很難

2、估計冷凍組織塊中的卵泡數量,卵巢組織塊中卵泡含量的不確定性大大降低了卵巢組織體外培養(yǎng)的價值。分離后卵泡的體外培養(yǎng)因能夠為輔助生殖技術提供實實在在的卵母細胞來源而優(yōu)于卵巢組織體外培養(yǎng)。
　　 目的
　　 本研究采用直接覆蓋玻璃化冷凍法凍存人類卵巢組織,解凍后分離卵泡,完整存活卵泡行體外培養(yǎng),使用藻酸鈣作為三維培養(yǎng)體系,在體外培養(yǎng)液中添加干細胞因子(stem cell factor,SCF,又稱kit配體)及白血病抑制因子(

3、leukaemiainhibitory factor,LIF),以探討體外培養(yǎng)條件下LIF與SCF對人原始卵泡生長發(fā)育的影響,研究最佳的體外培養(yǎng)條件。為構建人類卵子庫提供基礎研究。
　　 方法：
　　 人卵巢組織冷凍方案基本參照Chen等[1]報道的直接覆蓋玻璃化冷凍方案(DCV)。
　　 1.將所收集的18例卵巢組織分割成1mm×1mm×2mm的組織塊,隨機留2～3塊新鮮組織10％中性甲醛固定,部分新鮮組織用于

4、分離卵泡,其余組織全部用于直接覆蓋玻璃化冷凍保存；
　　 2.解凍后的卵巢組織隨機留2～3塊10％中性甲醛固定,其余組織全部用于分離卵泡；
　　 3.選取形態(tài)正常的卵泡隨機分成5組,添加不同成分的培養(yǎng)液,在藻酸鈣三維培養(yǎng)體系中體外培養(yǎng)8d。隔天半量換液,收集培養(yǎng)液置于-20℃冰箱保存,采用電化學發(fā)光免疫分析法(electrochemiluminescence immunoassay,ECLIA)測定雌二醇水平；0d、4d

5、、8d測卵泡直徑；臺盼藍染色評價卵泡活率。
　　 4.采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件對實驗數據進行統(tǒng)計學分析。
　　 結果：
　　 1.卵巢組織冷凍前后組間各級卵泡構成比例差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),組內各級卵泡構成比例差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),人卵巢組織中的卵泡主要為原始卵泡,其次為初級卵泡和次級卵泡,未見竇狀卵泡,且卵泡在組織中的分布不均勻；
　　 2.冷凍前后原始卵泡中異常卵泡所占比例

6、無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。各組內原始卵泡與初、次級卵泡相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),冷凍后初、次級卵泡的損傷程度較冷凍前增加,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；
　　 3.冷凍前后分離的卵泡絕大部分存活,冷凍過程對分離的各級卵泡的存活率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),但初、次級卵泡存活率較原始卵泡存活率偏低；
　　 4.隨著培養(yǎng)天數的增加,對照組卵泡直徑增長緩慢,明顯小于各實驗組(P<0.05)；而

7、在實驗組中,SCF和LIF聯(lián)合培養(yǎng)組中卵泡直徑增長迅速,較單獨培養(yǎng)組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),聯(lián)合培養(yǎng)組中,不同濃度的SCF組中卵泡直徑的增長速度相差不大,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；單獨SCF和LIF組相比,卵泡生長速度差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；
　　 5.隨著培養(yǎng)天數的增加,各組卵泡都具有分泌激素的功能。4天后對照組卵泡激素水平增長緩慢,明顯小于各實驗組(P<0.05),而在實驗組中,SCF和LIF聯(lián)合

8、培養(yǎng)組中卵泡激素分泌增長迅速,較單獨培養(yǎng)組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),聯(lián)合培養(yǎng)組中,不同濃度的SCF組中卵泡的激素增長速度相差不大,但在第4天差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；單獨SCF和LIF組相比,卵泡激素水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；
　　 6.體外培養(yǎng)8d后,采用臺盼藍染色評價各組卵泡的存活率,對照組的卵泡存活率明顯低于實驗組(P<0.05),而各實驗組相比卵泡存活率無明顯差異(P>0.05)。
　　

9、 結論：
　　 1.直接覆蓋玻璃化冷凍法操作簡單,耗時短,能夠很好的保存人卵巢組織中的卵泡,可用于人類卵巢組織的冷凍保存；
　　 2.冷凍過程對原始卵泡無明顯損傷,但對初、次級卵泡可造成一定程度的損傷；
　　 3.藻酸鈣能夠維持卵泡的完整結構,維持細胞間的縫隙連接,可以作為三維培養(yǎng)體系用于分離卵泡的體外培養(yǎng)；
　　 4.酶聯(lián)合機械分離卵泡的方法可以減輕單用酶對基底膜和卵泡膜所造成的損傷,使分離的卵泡保持