1、流行病學(xué)研究表明,室外空氣污染物中可吸入顆粒物(PM)與心血管疾病的發(fā)病率和死亡率有關(guān),而心血管疾病是嚴(yán)重威脅人類的健康與生命的重大疾病.因此,納米顆粒對(duì)心血管系統(tǒng)的毒性問題格外引人關(guān)注.迄今為止,我們尚未發(fā)現(xiàn)納米SiO<,2>對(duì)心血管系統(tǒng)影響的研究報(bào)道,目前的研究集中在肺部毒性方面,結(jié)果顯示納米SiO<,2>較微米二氧化硅可能有更強(qiáng)的脂質(zhì)過氧化、損害抗氧化系統(tǒng)傾向,引起更嚴(yán)重的肺部急性損傷.鑒于納米材料可能在心血管損害中起到非常重要的

2、作用,本項(xiàng)目擬以納米SiO<,2>為研究對(duì)象,采用體外、體內(nèi)和人群研究相結(jié)合的方法,較全面的觀察納米SiO<,2>對(duì)心血管系統(tǒng)的影響.這樣不僅可以從整體動(dòng)物水平觀察到納米SiO<,2>對(duì)心血管主要功能的影響,而且可以從體外實(shí)驗(yàn)深入了解納米SiO<,2>引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的分子機(jī)制.方法和結(jié)果本課題分以下三部分進(jìn)行研究: 研究一:納米SiO<,2>對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的毒性影響 方法:設(shè)置生理鹽水(NS

3、)對(duì)照組、微米SiO<,2>對(duì)照組(劑量同納米SiO<,2>高劑量)、納米SiO<,2>低劑量組、納米SiO<,2>中劑量組和納米SiO<,2>高劑量組5個(gè)劑量組,DNA損傷檢測增加10 μg/ml MNNG陽性對(duì)照組.觀察指標(biāo)包括IC<,50>、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、DNA損傷以及炎癥因子測定,處理時(shí)間均為24小時(shí).具體如下:不同濃度納米SiO<,2>(0～800 μg/ml)處理HUVECs,采用臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)測定IC<,50>,以5

4、0﹪IC<,50>為納米SiO<,2>高劑量;用Annexin V、PI雙染色細(xì)胞凋亡試劑盒和細(xì)胞周期試劑盒在流式細(xì)胞儀上觀察納米SiO<,2>對(duì)HUVECs細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響;DNA損傷檢測:各組細(xì)胞經(jīng)處理后用流式細(xì)胞儀和免疫熒光技術(shù)檢測HUVECs細(xì)胞核γH2AX的焦點(diǎn)形成情況;炎癥因子測定:HUVECs經(jīng)納米SiO<,2>處理后,用免疫試劑盒測定培養(yǎng)液中的腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素6(IL-6)和高敏C反應(yīng)蛋白

5、(hsCRP)的釋放情況. 結(jié)果:用概率單位法計(jì)算納米SiO<,2>作用于HUVECs 24小時(shí)的IC<,50>為194.9μg/ml.本試驗(yàn)中我們采用100 μg/ml(約50﹪IC<,50>)作為納米SiO<,2>的最高濃度.流式細(xì)胞儀檢測顯示,25 μg/ml、50μg/ml和100 μg/ml納米SiO<,2>組作用HUVECs24小時(shí)后細(xì)胞凋亡率分別為10.5﹪、17.9﹪和15.3﹪,與100 μg/ml微米SiO<

6、,2>組(7.5﹪)和NS對(duì)照組(5.5﹪)相比均有顯著性差異(p<0.05).100 μg/ml微米SiO<,2>和各劑量組納米SiO<,2>均顯著引起了細(xì)胞G1期阻滯,S期也顯著減少(p<0.05),而各劑量組納米SiO<,2>和微米SiO<,2>相比各期沒有顯著性差異(p>0.05);各劑量組納米SiO<,2>均可引起HUVECs顯著的DNA損傷,25μg/ml、50μg/ml和100 gg/ml作用24小時(shí)后的γH2AX陽性細(xì)胞

7、的百分率分別為14.2﹪、23.9﹪和25.9﹪,與100μg/ml微米SiO<,2>組(11.9﹪)和NS對(duì)照組(1.4﹪)相比均有顯著性差異(p<0.05);各劑量組納米SiO<,2>均可顯著促進(jìn)炎癥因子TNF-α的釋放,除25μg/ml組外,50μg/ml和100μg/ml納米SiO<,2>組可以顯著促進(jìn)IL-6和hsCRP的釋放.以上結(jié)果說明處理24小時(shí)后納米SiO<,2>對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞存在損害效應(yīng).除細(xì)胞周期外,納米SiO<,

8、2>所引起的效應(yīng)均比微米級(jí)SiO<,2>嚴(yán)重,說明SiO<,2>粒徑尺度的改變對(duì)其毒性有顯著影響. 研究二:納米SiO<,2>對(duì)大鼠心血管系統(tǒng)的毒性影響 方法:根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,設(shè)置NS對(duì)照組、微米SiO<,2>對(duì)照組(10 mg/kg)、納米SiO<,2>低劑量組(2.5 mg/kg)、納米SiO<,2>中劑量組(5mg/kg)和納米SiO<,2>高劑量組(10 mg/kg)5個(gè)劑量組,觀察指標(biāo)包括血壓、心率、血栓形成

9、時(shí)間、血小板計(jì)數(shù)和血小板聚集率.具體如下:1)對(duì)大鼠血壓和心率的影響:動(dòng)物麻醉后分離左頸總動(dòng)脈(約2 cm),血管插管接壓力換能器,用Medlab-E生物信號(hào)采集系統(tǒng)測量受試材料對(duì)血壓心率的影響.2)對(duì)血栓形成的影響:首先在Kura及唐映紅方法的基礎(chǔ)上構(gòu)建了FeCl<,3>血栓模型,分離左側(cè)頸動(dòng)脈按照血壓心率監(jiān)測方法做頸動(dòng)脈血管插管,MedLab-E生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)監(jiān)測血壓和心率信號(hào),各組處理時(shí)間均為4 h,另外對(duì)高劑量組給藥后0、

10、0.5h、1h、2h的血栓形成情況進(jìn)行觀察.處理時(shí)間到后用兩片滲透2.16 mol/LFeCl<,3>的濾紙敷在頸動(dòng)脈外膜表面(上下各一片),記錄FeCl<,3>使用后血壓曲線變成直線的時(shí)間(即血栓形成時(shí)間).3)血小板功能分析:尾靜脈給予受試物(200μl/只),觀察24 h后,自下腔靜脈采血5 ml(3.8﹪檸檬酸三鈉1:9抗凝),血細(xì)胞分析儀測定全血的血小板數(shù)目,分離血小板用血小板聚集儀上分析血小板的聚集情況.除此之外,我們還采集

11、正常大鼠血液,進(jìn)行了體外給藥對(duì)血小板聚集率的影響實(shí)驗(yàn). 結(jié)果:只有10 mg/kg納米SiO<,2>高劑量組給藥后2 h和4 h收縮壓和舒張壓與O時(shí)間點(diǎn)相比顯著性減小(p<0.05),各劑量組處理后各時(shí)間點(diǎn)心率與0時(shí)間點(diǎn)相比沒有顯著性差異(p>0.05).同樣也只有10 mg/kg納米SiO<,2>組處理2 h和4 h后的血栓形成時(shí)間與模型組相比顯著性縮短(p<0.05).動(dòng)物給藥觀察24 h后,10 mg/kg微米SiO<,2

12、>組和各劑量納米SiO<,2>組與NS對(duì)照組相比,血小板數(shù)量沒有顯著性差異(p>0.05),而5 mg/kg和10mg/kg納米SiO<,2>組均引起了大鼠血小板聚集率的顯著升高,與NS組和微米SiO<,2>組相比有顯著性差異(p<0.05).正常大鼠血小板體外實(shí)驗(yàn)顯示各劑量納米SiO<,2>組可促進(jìn)大鼠血小板的聚集,與NS組和微米SiO<,2>組相比有顯著性差異(p<0.05). 研究三:納米SiO<,2>對(duì)職業(yè)接觸人群心血

13、管系統(tǒng)的影響 方法:雖然全國納米SiO<,2>的生產(chǎn)規(guī)模較大,但生產(chǎn)納米SiO<,2>的職業(yè)工人數(shù)量并不多,所以我們準(zhǔn)備先進(jìn)行人群探索性研究.按照預(yù)定的入選標(biāo)準(zhǔn),我們暫時(shí)選擇了一家納米SiO<,2>生產(chǎn)規(guī)模較大廠家的納米SiO<,2>作業(yè)工人9人作為職業(yè)接觸組研究對(duì)象.由于人數(shù)較少,我們選取對(duì)照時(shí)進(jìn)行年齡、性別、體型以及生活習(xí)慣的適當(dāng)匹配,選擇非納米SiO<,2>接觸人員9人為對(duì)照.現(xiàn)場調(diào)查內(nèi)容包括作業(yè)環(huán)境衛(wèi)生調(diào)查、健康調(diào)查和抽

14、血檢驗(yàn).抽血檢驗(yàn)項(xiàng)目:1)血小板相關(guān)指標(biāo)測定,包括血小板計(jì)數(shù)(PLT)、平均血小板體積(MPV)、血小板壓積(PCT)和血小板分布寬度(PDW);2)凝血、抗凝和纖溶功能測定,包括血漿凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血酶時(shí)間(APTT)、凝血酶時(shí)間(TT)、纖維蛋白原(Fib)、抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)和D-二聚體;3)血脂及脂蛋白測定,包括總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-

15、C)、血漿載脂蛋白A-I(ApoA-I)及載脂蛋白B(ApoB);4)可溶性細(xì)胞間黏附分子-1(slCAM.1)和血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)檢測;5)炎癥因子測定:ELISA法測定血漿TNF-α(腫瘤壞死因子α)、IL-6(白細(xì)胞介素6)和hsCRP(高敏急性期反應(yīng)蛋白)的釋放水平. 結(jié)果:納米SiO<,2>接觸組和對(duì)照組相比,PLT、MPV、PCT和PDW均沒有顯著性差異(p>0.05);凝血功能四項(xiàng)(PT、APTT、TT和Fib)

16、以及AT-Ⅲ沒有顯著性差異(p>0.05),接觸組血漿D-二聚體顯著性升高(p<0.05);血脂及脂蛋白指標(biāo)中的TC、HDL-C、LDL-C、ApoA-I、ApoB和ApoA-I/ApoB均沒有顯著性差異(p>0.05),只有FG-項(xiàng)指標(biāo)明顯降低(p<0.05);血漿slCAM.1水平存在顯著性升高(p<0.05),而兩組間血漿TM以及TNF-α、IL-6和hsCRP均沒有顯著性差異(p>0.05). 結(jié)論: 1. 體外實(shí)驗(yàn)

17、:納米SiO<,2>具有顯著的HUVECs細(xì)胞毒性.除細(xì)胞周期外,納米SiO<,2>所引起的效應(yīng)均比微米SiO<,2>嚴(yán)重,說明SiO<,2>粒徑尺度的改變對(duì)其毒性有顯著影響. 2. 動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn):與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同,納米SiO<,2>對(duì)大鼠的心血管系統(tǒng)的毒性較弱,只有較大劑量(中劑量或高劑量)納米SiO<,2>組對(duì)大鼠的收縮壓、舒張壓、血栓形成以及血小板聚集率有顯著影響. 3. 人群研究:人群探索性研究并沒有發(fā)現(xiàn)納米SiO