1、一、目的與背景非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholicfattyliverdisease,NAFLD)是一種以肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪變性和脂肪儲(chǔ)積為病理特征，但無(wú)過(guò)量飲酒史的臨床病理綜合征，是臨床常見(jiàn)的肝臟疾病，其發(fā)病率逐年增高。全球流行病學(xué)調(diào)查表明，NAFLD的患病率為17％～33％。國(guó)內(nèi)范建高等對(duì)上海市3175例成人調(diào)查發(fā)現(xiàn)，NAFLD患病率為15.4％。NAFLD隨病情進(jìn)展表現(xiàn)不一，其疾病譜包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎(nonalco

2、holicsteatohepatitis，NASH)、脂肪性肝纖維化和肝硬化。NAFLD常與肥胖、高脂血癥和2型糖尿病等疾病伴隨，其實(shí)質(zhì)是代謝綜合征在肝臟的表現(xiàn)。NAFLD發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、免疫及各種細(xì)胞因子作用、遺傳因素等和NAFLD發(fā)病有一定關(guān)系，其中胰島素抵抗(Insulinresistance,IR)和脂肪組織脂解增高是NAFLD發(fā)病機(jī)制的中心環(huán)節(jié)。相應(yīng)發(fā)生的高胰島素血癥和高游離脂肪酸(freefatt

3、yacids,FFA)血癥兩個(gè)基本代謝缺陷，可引起葡萄糖毒性和脂肪毒性而造成肝損害，并誘發(fā)系統(tǒng)性代謝應(yīng)激，從而產(chǎn)生代謝功能不全。 隨著對(duì)NAFLD研究的深入，發(fā)現(xiàn)天然免疫在其發(fā)病中起一定作用，其中自然殺傷T(naturalkillerT，NKT)細(xì)胞與NAFLD的關(guān)系極為密切。NKT細(xì)胞是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類具有天然免疫特性的T細(xì)胞亞群，同時(shí)表達(dá)NK細(xì)胞標(biāo)志和恒定的T細(xì)胞受體(TCR)αβ(人為Vα24/Vβ11，鼠為Vα14/Vβ

4、8)，主要識(shí)別抗原提呈細(xì)胞表面CD1d分子提呈的糖脂類抗原后活化，并迅速釋放大量干擾素(IFN)-γ和白介素(IL)-4等細(xì)胞因子，通過(guò)調(diào)節(jié)Th1類細(xì)胞因子(促炎因子)和Th2類細(xì)胞因子(抗炎因子)間的平衡，在抗感染、抗腫瘤、移植免疫、自身免疫病等方面發(fā)揮重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，多種NAFLD模型小鼠的肝臟NKT細(xì)胞數(shù)量下降，且通過(guò)不同方法增加NKT細(xì)胞數(shù)量后能有效降低NAFLD模型小鼠肝臟脂肪含量。但是這些結(jié)果均來(lái)源于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，NAF

5、LD患者體內(nèi)NKT細(xì)胞變化情況如何，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)NAFLD患者與正常人外周血NKT細(xì)胞的變化進(jìn)行研究，以期探索NKT細(xì)胞在NAFLD發(fā)病機(jī)制中的作用。 二、資料與方法1.研究對(duì)象所有研究對(duì)象均來(lái)源于2005年9月至2005年10月于我院參加體檢者。根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝臟病分會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組2002年制定的NAFLD的診斷標(biāo)準(zhǔn)，選取NAFLD患者，并排除其中合并(1)近3個(gè)月內(nèi)有感染或組織損傷者。

6、 (2)有肝炎、惡性腫瘤或自身免疫性疾病病史者。(3)近三個(gè)月內(nèi)有使用降血脂、降血糖、降血壓等藥物者。(4)年齡大于65歲或小于18歲者。共入選NAFLD患者60例，其中男性50例，女性10例，年齡25～65歲，平均年齡43.0±10.15歲。按1：1選取年齡(上下相差3歲以內(nèi))、性別配對(duì)的正常對(duì)照60例，對(duì)照組B超檢查無(wú)肝膽系統(tǒng)疾病，每周酒精攝入量小于40g，排除標(biāo)準(zhǔn)同NAFLD組。 2.臨床及實(shí)驗(yàn)室資料的獲取經(jīng)詳細(xì)詢問(wèn)健

7、康狀況及生活習(xí)慣等內(nèi)容后，用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)量各入選對(duì)象的身高、體重、腰圍(WC)、臀圍、血壓等；根據(jù)上述結(jié)果計(jì)算體重指數(shù)(BMI)和腰/臀比(WHR)。并于清晨、空腹、靜息狀態(tài)下抽取肘靜脈血10ml，用于NKT細(xì)胞比例，肝酶(ALT、AST、GGT)，血脂(TG、TC、HDL-C、LDL-C、VLDL-C)，空腹血糖(FBS)以及肝炎標(biāo)志物等項(xiàng)目的檢測(cè)。 3.外周血NKT細(xì)胞比例檢測(cè)取新鮮EDTA抗凝全血50μL于流式細(xì)胞試管中，加

8、入FITC標(biāo)記的抗TCRVα24單克隆抗體10μL，25℃避光孵育30min后，加入2mL紅細(xì)胞裂解液，迅速混勻后1200r/min離心5min，去上清液；加PBS液1ml洗滌，雨次1200r/min離心5min，去上清液；重復(fù)洗滌1次；加PBS液1ml混勻后立即上機(jī)檢測(cè)。所有樣品用EPICS-XL型流式細(xì)胞儀SystemⅡ軟件進(jìn)行分析，激發(fā)光為488nm激光，前向散射(FSC)和側(cè)向散射(SSC)以線性信號(hào)收集。先在FSC-SSC散點(diǎn)

9、圖上劃出淋巴細(xì)胞區(qū)，然后檢測(cè)淋巴細(xì)胞上的FITC熒光強(qiáng)度。測(cè)定時(shí)熒光通道以相應(yīng)同種型IgG1染色細(xì)胞作陰性對(duì)照。 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理利用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，組間計(jì)量資料比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析應(yīng)用Pearson相關(guān)分析，并應(yīng)用向后逐步選擇法Logistic回歸分析NAFLD的危險(xiǎn)因素，建立回歸方程。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果1.NAFLD患者組與正常對(duì)照組各臨床變量比較NAFLD患者組B

10、MI為(26.9±2.7)kg/m2，WC為(92.0±8.3)cm，臀圍為(100.3±5.4)cm，WHR為(0.92±0.05)，平均動(dòng)脈壓為(96.9±10.6)mmHg，ALT為(46.8±28.2)U/L，AST為(36.0±21.2)U/L，GGT為(38.9±21.0)U/L，TG為(2.64±1.12)mmol/L，TC為(4.99±0.91)mmol/L，F(xiàn)BS為(5.70±2.43)mmol/l；而正常對(duì)照組分別為

11、(22.4±2.2)kg/m2，(80.2±6.0)cm，(93.7±3.9)cm，(0.86±0.04)，(88.9±12.6)mmHg，(21.5±13.6)U/L，(24.5±8.3)U/L，(26.3±22.8)U/L，(1.71±1.09)mmol/L，(4.58±0.85)mmol/L和(4.39±0.48)mmol/L，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。NAFLD患者組年齡為(43.0±10.15)yrs、身高為(

12、167.3±7.1)cm、HDL-C為(1.28±0.25)mmol/L、LDL-C為(2.73±0.76)mmol/L；而正常對(duì)照組分別為(43.0±9.7)yrs，(166.7±6.3)cm，(1.26±0.21)mmol/L,(2.53±0.74)mmol/L,兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05) 2.NAFLD患者組與正常對(duì)照組外周血NKT細(xì)胞比例比較本研究將Vα24+T細(xì)胞定義為NKT細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)正常人外周血中含有少

13、量NKT細(xì)胞，約占淋巴細(xì)胞總數(shù)的(1.62±0.55)％；而NAFLD患者組外周血NKT細(xì)胞比例為(1.21±0.47)％，明顯低于正常組，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.275,P＜0.001)。 3.外周血NKT細(xì)胞比例與各臨床變量之間的關(guān)系經(jīng)Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：外周血NKT細(xì)胞比例與BMI、腰圍、ALT均有一定的負(fù)相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r值分別為-0.283,-0.251，-0.258；P值分別為0.002,0.00

14、6,0.004)。 4.NAFLD危險(xiǎn)因素分析入選上述差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量，排除體重和WC，將剩余的12個(gè)變量定義為自變量，是否為NAFLD定義為因變量(賦值正常對(duì)照組為0，NAFLD組為1)，應(yīng)用向后逐步選擇法Logistic回歸分析篩選出4個(gè)變量和一個(gè)常數(shù)項(xiàng)。根據(jù)上述結(jié)果建立回歸方程，P=1/(1+e41.037+2.527NKT-1.372BMI-0.155AST-1.237FBS)。篩出的四個(gè)變量均P＜0.05，可將外