1、創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)誘發(fā)神經(jīng)元病理性壞死和凋亡是腦功能障礙的重要原因.腦創(chuàng)傷后機(jī)械性損傷導(dǎo)致神經(jīng)元直接損傷死亡,伴隨腦水腫、缺血及再灌注等繼發(fā)性損傷引起離子失衡、興奮氨基酸增加及其受體激活、氧自由基、NO釋放增加等改變和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境紊亂,可造成繼發(fā)性神經(jīng)元損傷和凋亡.TBI后的治療措施有:挽救受損神經(jīng)元的遲發(fā)性死亡;促進(jìn)神經(jīng)元軸突的再生;組織移植替代神經(jīng)元缺損.目前的研究,主要運(yùn)用神經(jīng)營養(yǎng)因子 (NTs)、促神經(jīng)生長因子(neuropo

2、ietic cytokines)、細(xì)胞保護(hù)因子(bFGF等)、再生相關(guān)因子(RAGs)等促進(jìn)神經(jīng)元生長存活以及軸突再生,以組織細(xì)胞移植替代缺損的神經(jīng)組織,其目的是減少受損神經(jīng)元遲發(fā)性死亡,提供一個有利于神經(jīng)軸突再生的微環(huán)境,使移植細(xì)胞組織在宿主實(shí)現(xiàn)解剖重建,促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù).成年哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)損傷后不能再生,神經(jīng)聯(lián)接和功能重建能力差,是腦創(chuàng)傷后神經(jīng)功能恢復(fù)困難的主要原因.但近年實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)成年CNS中仍然存在少量具有分裂增

3、殖和多分化潛能的神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs),可分化為CNS中的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,對CNS損傷的修復(fù)有潛在意義,但對創(chuàng)傷性腦損傷,內(nèi)源性NSCs遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠修復(fù)腦組織創(chuàng)傷后的神經(jīng)缺損.NSCs的發(fā)現(xiàn)給CNS疾患和損傷的治療修復(fù)帶來了希望.NSCs具有自我更新和多向分化潛能,可分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞等.從再生方面人們把NSCs視為CNS移植和替代治療的理想材料,國內(nèi)外學(xué)者在CNS損傷后應(yīng)用NSCs移植治療神經(jīng)功能障礙的實(shí)驗(yàn)研究

4、和臨床應(yīng)用中獲得了一定結(jié)果,但NSCs移植后在宿主中的生長分化和軸突重建仍是目前的難點(diǎn).心肌營養(yǎng)素-1(CT-1)是近年發(fā)現(xiàn)并被逐漸深入研究的一種細(xì)胞因子,與節(jié)狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)同屬于促神經(jīng)元生長細(xì)胞因子家族(neuropoietic cytokines family),能夠刺激體外新生大鼠心肌的生長,故命名為CT-1.近來人們注意到CT-1在CNS中也有重要作用,能支持運(yùn)動神經(jīng)元、多巴胺神經(jīng)元、交感神經(jīng)元和脊髓運(yùn)動神經(jīng)元存活,

5、誘導(dǎo)交感神經(jīng)元的表型連接.目前認(rèn)為,CT-1可能是靶源性和/或自分泌/旁分泌的運(yùn)動、感覺神經(jīng)元的營養(yǎng)因子,有比CNTF更強(qiáng)的對神經(jīng)元存活的調(diào)節(jié)作用.實(shí)驗(yàn)證明,脊髓損傷(SCI)后CT-1的基因治療可明顯增加神經(jīng)元的存活數(shù)量和損傷神經(jīng)功能的恢復(fù),CT-1聯(lián)合膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF )治療可促進(jìn)周圍神經(jīng)再生,CT-1基因治療大鼠進(jìn)行性運(yùn)動神經(jīng)元病也可明顯改善動物的神經(jīng)功能障礙.應(yīng)用細(xì)胞因子治療腦損傷時,因?yàn)橹苯邮褂眉?xì)胞因子作用存在血

6、腦屏障、體內(nèi)半衰期較短等問題,因而限制了其應(yīng)用.腺病毒對神經(jīng)細(xì)胞有著特異性親和性,重組腺病毒(Adv)可作為良好的基因載體將目的基因?qū)隢SCs或神經(jīng)元,使外源性基因在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄、復(fù)制,從而在宿主特定部位的細(xì)胞中較長時間持續(xù)表達(dá).有實(shí)驗(yàn)證明,以GDNF和CT-1基因的腺病毒轉(zhuǎn)染對PC12細(xì)胞的保護(hù)作用可明顯大于直接使用細(xì)胞因子.對NSCs在移植前進(jìn)行特定的基因修飾,使NSCs成為良好的基因載體,為NSCs以及特定基因的移植治療神經(jīng)缺損提

7、供了新的方法.NSCs移植后在大腦局部增殖分化可替代損傷缺失的腦組織,修飾的外源性神經(jīng)保護(hù)因子則可促進(jìn)損傷細(xì)胞和移植細(xì)胞的存活,有利于神經(jīng)功能恢復(fù).CT-1能否挽救損傷大腦神經(jīng)元的遲發(fā)性死亡,是否對NSCs的生長存活有保護(hù)作用,能否促進(jìn)移植到損傷大腦內(nèi)的NSCs在宿主內(nèi)的存活與分化,這些問題目前尚未見有關(guān)文獻(xiàn)報道.該實(shí)驗(yàn)擬通過體外實(shí)驗(yàn)研究CT-1對NSCs和神經(jīng)元的作用,于在體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究CT-1對腦創(chuàng)傷的治療效應(yīng)以及對NSCs在體內(nèi)

8、生長分化的作用,了解CT-1對CNS的作用和機(jī)理,為腦創(chuàng)傷提供新的治療策略.該實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹饕隗w外培養(yǎng)的NSCs和神經(jīng)元模型上觀察重組腺病毒-CT1(Adv-CT1)的作用;制備腦創(chuàng)傷模型基礎(chǔ)上,觀察Adv-CT1對損傷神經(jīng)元存活的保護(hù)作用,Adv-CT1及其修飾的NSC(NSC-CT1)腦內(nèi)移植治療TBI后的腦功能障礙的作用,探索CT-1和NSCs對TBI治療的作用和機(jī)制.主要技術(shù)路線和方法:1.分離、培養(yǎng)和鑒定大鼠NSCs,以Adv-

9、CT1轉(zhuǎn)染NSCs,應(yīng)用流式細(xì)胞儀凋亡檢測、細(xì)胞突起計數(shù)等技術(shù),觀察CT-1對NSCs存活和分化的作用.2.建立H2O2氧化應(yīng)激誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡損傷模型,以Adv-CT1轉(zhuǎn)染損傷神經(jīng)元,應(yīng)用流式細(xì)胞儀凋亡檢測、免疫組化等技術(shù),觀察CT-1對神經(jīng)元生長存活的作用.3.建立大鼠TBI模型,以Adv-CT1轉(zhuǎn)染治療后應(yīng)用電鏡、原位凋亡檢測、流式細(xì)胞儀凋亡檢測、免疫組化、水迷宮試驗(yàn)和穿梭箱試驗(yàn)等檢測技術(shù),觀察CT-1對TBI后神經(jīng)功能障礙的修復(fù)作

10、用.4.在大鼠TBI模型上,以CT-1基因修飾的NSCs移植治療,應(yīng)用移植細(xì)胞示蹤、免疫熒光、水迷宮試驗(yàn)和穿梭箱試驗(yàn)等檢測技術(shù),觀察CT-1基因修飾的NSCs移植后在宿主損傷腦區(qū)中的存活分化及其對TBI后神經(jīng)功能障礙的影響.主要結(jié)果和結(jié)論:1.從胚胎大鼠大腦分離出NSCs,采用條件培養(yǎng)基成功培養(yǎng)NSCs,經(jīng)Brdu摻入實(shí)驗(yàn)證明NSCs具有分裂增殖能力;以免疫組化檢測NSCs標(biāo)志物nestin、神經(jīng)元標(biāo)志物NF-200和膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GF

11、AP,證實(shí)經(jīng)誘導(dǎo)NSCs可分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞,具有多向性分化潛能.以Adv-CT1轉(zhuǎn)染NSCs后應(yīng)用免疫組化技術(shù),檢測到NSCs中CT-1表達(dá)明顯增強(qiáng),并可持續(xù)表達(dá);熒光顯微鏡下觀察到NSCs中出現(xiàn)大量EGFP陽性細(xì)胞,表明外源性CT-1和EGFP基因轉(zhuǎn)染到NSCs內(nèi),且可持續(xù)穩(wěn)定表達(dá).2.以Adv-CT1轉(zhuǎn)染NSCs,NSC的神經(jīng)球計數(shù)和分化細(xì)胞突起計數(shù)指標(biāo)證實(shí)CT-1可促進(jìn)NSCs的增殖能力,并增加誘導(dǎo)分化后細(xì)胞突起的生長;在H

12、2O2誘導(dǎo)NSCs凋亡模型中以Adv-CT1治療,通過流式細(xì)胞儀AnnexinV-PI雙標(biāo)檢測技術(shù)發(fā)現(xiàn),CT-1可減輕NSCs的凋亡,促進(jìn)細(xì)胞存活. 3.應(yīng)用bFGF低劑量無血清條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)NSCs定向分化,神經(jīng)元生長良好且數(shù)量比例優(yōu)于直接培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元,以此方法可成功建立培養(yǎng)神經(jīng)元模型.在H2O2誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡模型中轉(zhuǎn)染Adv-CT1,應(yīng)用免疫組化檢測CT-1和caspase-3的表達(dá),觀察到神經(jīng)元中CT-1表達(dá)增高,caspas

13、e-3表達(dá)降低;應(yīng)用流式細(xì)胞儀AnnexinV-PI雙標(biāo)檢測技術(shù),觀察到CT-1可減輕損傷神經(jīng)元凋亡比例,促進(jìn)細(xì)胞存活.4.以Allen's方法建立大鼠TBI模型,應(yīng)用電鏡、免疫組化、TUNEL、流式細(xì)胞儀檢測等技術(shù),觀察到TBI后12h-7d大腦皮層和海馬等損傷腦區(qū)細(xì)胞凋亡增加,存活細(xì)胞減少,凋亡基因caspase-3的表達(dá)增加;利用Adv-CT1轉(zhuǎn)染治療,可觀察到傷后12h-7d損傷腦區(qū)凋亡細(xì)胞減輕,存活細(xì)胞增加,促凋亡基因casp

14、ase-3的表達(dá)減少.提示CT-1對TBI后腦細(xì)胞的生存有保護(hù)作用.5.利用EGFP標(biāo)記的NSC-CT1或NSC移植到TBI大鼠損傷皮層和海馬區(qū),應(yīng)用熒光標(biāo)記示蹤、免疫熒光技術(shù),觀察到移植后3-28d中移植的NSCs可在宿主移植區(qū)存活生長,并可進(jìn)行局部遷移,能與周圍腦組織發(fā)生聯(lián)系融合,替代缺損的神經(jīng)組織;同時NSCs在宿主中還可分化為NF-200陽性神經(jīng)元;與單純NSCs移植相比,CT-1修飾的NSCs移植后,其NSCs在宿主的存活生長

15、狀態(tài)較好,且分化為神經(jīng)元的數(shù)量也較多.結(jié)果表明,移植到TBI大鼠損傷腦區(qū)NSCs可在移植區(qū)存活生長,并可分化為神經(jīng)元,是腦創(chuàng)傷神經(jīng)功能修復(fù)的重要基礎(chǔ).CT-1對移植NSCs的存活和分化有促進(jìn)作用.6.以Adv-CT1轉(zhuǎn)染治療TBI或NSC-CT1移植治療TBI,通過觀察水迷宮、穿梭箱實(shí)驗(yàn),可見傷后3-14d中,動物的迷宮潛伏期減少、主動回避次數(shù)增加、失敗次數(shù)減少,證明CT-1或 NSC-CT1可改善大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙,對TBI后神經(jīng)功