1、研究背景：
　　惡性腫瘤(尤其是肺癌)是嚴重危害人類健康的疾病,手術(shù)和放化療作為傳統(tǒng)的治療手段,療效有限,難以完全清除癌細胞,且對機體有明顯毒副作用,易產(chǎn)生多種并發(fā)癥。目前,提高生活質(zhì)量和生存期已成為腫瘤治療的首要原則,故T淋巴細胞過繼免疫治療逐漸受到臨床醫(yī)師的高度重視。
　　CD8+T淋巴細胞是特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答的關(guān)鍵細胞,探討和闡明CD8+T淋巴細胞的調(diào)控機制,對于腫瘤免疫治療的研究具有重大價值。作為CD8+T淋巴細胞

2、的亞群細胞,效應(yīng)性T淋巴細胞(effectorTcells,Te)和記憶性T淋巴細胞(memoryTcells,Tm)具有完全不同的生物學(xué)活性。Te是殺傷腫瘤細胞的主要效應(yīng)細胞,但在發(fā)揮免疫作用后的較短時間內(nèi)發(fā)生自我凋亡;Tm的功能狀態(tài)相對靜止,但具有自我穩(wěn)定更新的能力,可以長期存活二級淋巴組織中,直到再次接觸相同的抗原后產(chǎn)生強烈的二次免疫應(yīng)答。另一方面,已有大量的研究證實微小RNA(microRNAs,miRNA)在適應(yīng)性免疫應(yīng)答的精

3、細調(diào)控中發(fā)揮了重要作用。結(jié)合以上理論,我們設(shè)想,通過比較荷瘤(Lewis肺癌)小鼠脾臟CD8+Te和Tm的miRNA表達譜,分析二者之間明顯差異表達的miRNA并從中篩選出參與調(diào)控CD8+T淋巴細胞免疫應(yīng)答的miRNA作為研究目標,有可能進一步實現(xiàn)調(diào)控CD8+T淋巴細胞的抗腫瘤活性,并為特異性腫瘤細胞免疫的機制研究提供新的思路。
　　目的：
　　本課題擬分離荷瘤小鼠脾臟的Te和Tm,比較二者的miRNA表達譜芯片,在明顯差異

4、表達的miRNAs中確定參與調(diào)控CD8+T淋巴細胞功能的目標miRNA,并分析目標miRNA對CD8+T淋巴細胞的作用機制和其相應(yīng)的下游靶基因。
　　方法：
　　1.應(yīng)用Lewis肺癌細胞建立C57BL/6荷瘤小鼠模型,分離并純化荷瘤小鼠脾臟的CD8+Te和CD8+Tm,分析它們的miRNA表達譜并經(jīng)qRT-PCR驗證,選擇二者間差異表達的miRNA(miRNA-15b)作為研究對象。
　　2.觀察miRNA-15b在

5、健康小鼠和荷瘤小鼠的CD8+T淋巴細胞之間表達有無差異,并觀察miRNA-15b在CD8+T淋巴細胞活化過程中的含量變化情況。
　　3.通過人工合成的miRNA-15bmimic轉(zhuǎn)染CD8+T淋巴細胞,實現(xiàn)miRNA-15b在體外CD8+T淋巴細胞中的過表達。
　　4.通過細胞凋亡檢測試劑盒、流式細胞術(shù)、ELISA檢測試劑盒和CFSE增殖試劑盒在體外檢測過表達miRNA-15b對CD8+T淋巴細胞的凋亡、細胞因子分泌、(活化

6、和記憶)表型以及增殖等功能的影響。
　　5.通過生物信息學(xué)軟件和雙熒光素酶報告實驗進一步篩選和驗證miRNA-15b潛在的,且與T淋巴細胞功能相關(guān)的下游靶基因。
　　結(jié)果：
　　1.miRNA表達譜芯片分析和qRT-PCR證實miRNA-15b在荷瘤小鼠脾臟的CD8+Tm中的含量明顯高于CD8+Te(3倍以上)。
　　2.miRNA-15b(較之健康小鼠)高表達于荷瘤小鼠的脾臟CD8+T淋巴細胞。
　　3.

7、miRNA-15b在CD8+T淋巴細胞中的表達含量與CD8+T淋巴細胞自身的活化程度呈負相關(guān)。
　　4.過表達的miRNA-15b能增強CD8+T淋巴細胞的抗凋亡能力。
　　5.miRNA-15b能通過一些尚未明確的靶點或機制抑制CD8+T淋巴細胞的活化(包括抑制其分泌IL-2和IFN-γ,抑制CD69的表達),并促進CD8+T淋巴細胞的記憶性表型(CD44)表達。
　　6.過表達的miRNA-15b未對CD8+T淋巴

8、細胞的增殖產(chǎn)生明顯的調(diào)控作用。
　　7.DEDD是miRNA-15b的一個靶基因,過表達的miRNA-15b能抑制CD8+T淋巴細胞中DEDD的表達。
　　結(jié)論：
　　腫瘤環(huán)境能促使小鼠脾臟CD8+T淋巴細胞中miRNA-15b的含量上調(diào),同時體外高表達的miRNA-15b能抑制CD8+T淋巴細胞的活化(包括抑制CD8+T淋巴細胞分泌IL-2和IFN-γ,抑制CD8+T淋巴細胞表面活化分子CD69的表達);另一方面,m