1、目的:毛乳頭細(xì)胞(dermal papilla cells,DPCs)是一組位于毛囊基底部的真皮源性細(xì)胞,對毛囊的生長發(fā)育、周期調(diào)控以及維持毛發(fā)生長起著主導(dǎo)作用。毛乳頭細(xì)胞結(jié)構(gòu)或功能的異常是導(dǎo)致毛囊生長失衡的主要起始因素。毛乳頭空間位置隱蔽,給毛乳頭的分離培養(yǎng)帶來了一定困難,但由于其重要的生理作用,人們對毛乳頭細(xì)胞的研究一直沒有間斷過,并逐漸成為毛囊生長發(fā)育及周期調(diào)控的研究的熱點(diǎn)。體外培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞在形態(tài)上類似成纖維細(xì)胞,但本質(zhì)上卻不

2、同于成纖維細(xì)胞。在生長方式上,培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞最明顯的特征是細(xì)胞融合前形成的多層化的細(xì)胞團(tuán)塊,即凝集性生長的特性。但毛乳頭細(xì)胞的凝集性生長特性將隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增多而逐漸減弱,一般情況下,第7代以后的毛乳頭細(xì)胞將失去凝集性生長的能力。凝集性生長是毛乳頭細(xì)胞重要的生物學(xué)特性之一與毛乳頭細(xì)胞的生物學(xué)功能密切相關(guān)。有研究證明,低傳代毛乳頭細(xì)胞的條件培養(yǎng)基能使高傳代毛乳頭細(xì)胞恢復(fù)凝集生長的現(xiàn)象,毛乳頭細(xì)胞在低傳代時(shí)許多細(xì)胞因子表達(dá)呈陽性隨著傳

3、代次數(shù)的增多逐漸轉(zhuǎn)為陰性。由此推測低傳代的毛乳頭細(xì)胞分泌或表達(dá)的某些生長因子的變化可能與毛乳頭細(xì)胞凝集性生長的狀態(tài)有關(guān)。已有研究證明,毛乳頭細(xì)胞能分泌多種生長因子如血管內(nèi)皮生長因子,肝細(xì)胞生長因子,轉(zhuǎn)化生長因子-β,胰島素樣生長因子-Ⅰ等。但具體是何種生長因子,通過何種途徑,起著何種作用還值得進(jìn)一步研究。對毛乳頭細(xì)胞的相關(guān)因子進(jìn)行研究有助于了解毛乳頭細(xì)胞在毛囊生長發(fā)育、周期調(diào)控和毛發(fā)生長過程中所起的作用,對毛發(fā)相關(guān)疾病的治療及皮膚組織工

4、程學(xué)的進(jìn)展具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)旨在通過對毛乳頭細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法進(jìn)行改良,獲得足夠的毛乳頭細(xì)胞;對體外不同傳代培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞干細(xì)胞因子(SCF)及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)進(jìn)行觀察;并觀察SCF及VEGF對體外培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞生長增殖的影響。
　　 方法:
　　 1毛乳頭細(xì)胞的分離培養(yǎng)及一般生長特性觀察。采用改良毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)法[1],獲得足夠的細(xì)胞培養(yǎng)于10％的DMEM培養(yǎng)基中,置于37℃、飽和濕度、5％的C

5、O2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及生長狀態(tài)。
　　 2α-平滑肌肌動(dòng)蛋白染色、甲苯胺藍(lán)染色、PAS染色鑒定毛乳頭細(xì)胞。
　　 3應(yīng)用免疫組化SP法及流式細(xì)胞儀(FCM)測不同傳代次數(shù)的毛乳頭細(xì)胞SCF及VEGF的表達(dá)變化情況。
　　 4采用MTT比色法繪制毛乳頭細(xì)胞生長曲線用于觀察SCF及VEGF對毛乳頭細(xì)胞生長增殖的影響。
　　 5運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

6、r>　　 結(jié)果:
　　 1在毛乳頭的分離過程中我們采用改良毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)法,不但節(jié)約了標(biāo)本并且降低了勞動(dòng)難度,成功的進(jìn)行了毛乳頭細(xì)胞的分離培養(yǎng)。分離的毛乳頭細(xì)胞純度高、貼壁迅速,并且培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞具有典型的生長特性:凝集性生長。凝集性生長的特性隨著傳代次數(shù)的增多逐漸減弱,7代以后完全消失。
　　 2所獲得的細(xì)胞經(jīng)免疫組化染色胞漿內(nèi)表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白;甲苯胺藍(lán)染色呈異染性;PAS染色細(xì)胞胞漿為紅色。
　　

7、3免疫組織化學(xué)法檢測不同傳代次數(shù)的毛乳頭細(xì)胞SCF及VEGF的表達(dá)情況。SCF及VEGF主要表達(dá)于胞漿內(nèi),隨著傳代次數(shù)的增多,表達(dá)逐漸減弱。
　　 4流式細(xì)胞儀(FCM)測不同傳代次數(shù)的毛乳頭細(xì)胞SCF及VEGF的表達(dá)情況。用均道值來表示生長因子的表達(dá)量。對3代、6代,6代、9代的SCF及VEGF的均道值進(jìn)行兩兩比較,統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析具有顯著性差異(P＜0.05),隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增多生長因子的表達(dá)量不斷減少。
　　 5

8、SCF組及VEGF組與對照組相比較,細(xì)胞生長曲線的停滯期減少提前進(jìn)入對數(shù)生長期,SCF組及VEGF組于對照組的OD值相比較明顯升高,統(tǒng)計(jì)分析表明有顯著性差異(P＜0.05),可見SCF及VEGF對毛乳頭細(xì)胞的生長有明顯的促進(jìn)作用。
　　 結(jié)論:
　　 1在人毛乳頭的分離過程中我們利用改良毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)法,用少量的標(biāo)本,成功分離到了高純度的毛乳頭細(xì)胞,且體外培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞呈典型的凝聚性生長,α-平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)陽性,毛