1、目的:
　　毛冬青為冬青科植物毛冬青(Ilex pubescens Hook.Et Am.)的干燥根，具有清熱解毒、活血通絡的功效，臨床上廣泛應用于治療冠心病、心絞痛和脈管炎等疾病。是華南地區(qū)的民間常用藥。毛冬青生長周期長且以根部入藥，資源再生能力差?，F(xiàn)階段人工栽培較少主要依賴野生資源供給市場需求，野生資源蘊藏量逐年下降。目前市售藥材中已經(jīng)普遍存在莖枝混用的現(xiàn)象，部分商販將禿毛冬青(Ilex pubescens var.glabr

2、a)作為毛冬青入藥使用。密蘇里植物園(Missouri Botanical Garden)于2012年將禿毛冬青作為毛冬青同物異名進行處理，新版中英文《中國植物志》亦未收載該品種。因此明確毛冬青種質(zhì)資源，建立精準、快捷有效的鑒別方法勢在必行。
　　方法:
　　本研究采用ISSR分子標記對華南5省的毛冬青樣品進行鑒定，嘗試從分子水平上對毛冬青和禿毛冬青進行區(qū)分，明確毛冬青藥用植物基源;采用高效液相法對毛冬青內(nèi)不同部位，不同采收

3、時間的樣品中特征性成分進行分析，在實現(xiàn)快速鑒定的同時為毛冬青的大范圍規(guī)范化種植奠定基礎。
　　結(jié)果:
　　1.建立蛋白酶K-mCTAB法用于毛冬青cDNA的提取，采用CTAB free的緩沖液A對液氮粉碎后的毛冬青組織進行抽提，去除大部分酚類和部分水溶性次生代謝產(chǎn)物，加入蛋白酶K提升了核酸產(chǎn)率的同時減少蛋白雜質(zhì)污染。實驗結(jié)果顯示，采用優(yōu)化后的方法毛冬青cDNA產(chǎn)率較DP305試劑盒提取結(jié)果提升最少4倍，且純度高、帶型完整，能

4、夠滿足后續(xù)實驗要求。
　　2.采用正交設計法對毛冬青ISSR反應體系進行優(yōu)化，最終優(yōu)化結(jié)果為Mg2+:2.5mmol·L-1, dNTPs:0.15 mmol·L-1,Primer:0.4μmol·L-1, DNA:70ng, Taq:0.5 U，共篩選11條引物及退火溫度用于后續(xù)研究。28個樣品共擴增出條帶2531條，平均每個引物擴增出230.1條，其中多態(tài)性條帶1870條，占比74％，平均每個引物170條。
　　3.28

5、個樣品的相似系數(shù)介于0.6478-0.9870之間，平均相似系數(shù)為0.7693。其中來自廣東省樂昌市的A5與來自廣東省梅州市平遠縣芋麻神下的A27相似系數(shù)最小為0.6478差異最大;來自廣東省梅州市平遠縣牛神坑的A24與廣東省梅州市平遠縣芋麻神下的A27樣品相似系數(shù)最高為0.9870相似度最高。禿毛冬青樣品與其他樣品相比存在明顯的差異。所有樣品主要遺傳距離主要分布在0.75-0.775范圍內(nèi)，禿毛冬青組間遺傳距離主要分布在0.725-0

6、.75之間，內(nèi)遺傳距離主要分布在0.8-0.825之間。UPGMA法聚類分析結(jié)果顯示禿毛冬青在0.34水平上與毛冬青形成明顯的分支，證明篩選出的11條ISSR引物能夠在分子水平上對毛冬青和禿毛冬青進行區(qū)分。
　　4.基于28份基因池擴增結(jié)果，經(jīng)篩選，去除出現(xiàn)概率＜18％的序列建立毛冬青ISSR指紋圖譜。采用5份隨機毛冬青樣品和5份隨機禿毛冬青樣品的驗證試驗顯示:5個毛冬青樣品擴增結(jié)果與毛冬青ISSR指紋圖譜相似度介于0.8371-

7、0.8962，5個禿毛冬青樣品擴增結(jié)果與毛冬青ISSR指紋圖譜相似度介于0.6831-0.7411.證明毛冬青ISSR指紋圖譜能夠?qū)γ嗪投d毛冬青進行區(qū)分。
　　5.高效液相法對不同部位樣品檢測結(jié)果顯示:ilexsaponin A1含量根＞莖＞細枝，ilexsaponin B1含量細枝＞根＞莖。其中ilexsaponin A1含量根中含量比例為的45％-66％以上，細枝含量最低，含量比例為6％-27％，莖含量介于兩者之間，為27

8、％-39％。ilexsaponin B1含量細枝中含量比例最大，達到56％-75％，莖中含量最低，為10％-15％，根中含量介于兩者之間，為15％-30％。不同植株間雖存在一定的個體差異，但是其總體趨勢相同。針對不同采收時間樣品的研究顯示ilexsaponinA1，ilexsaponin B1兩個目標成分的含量隨時間變化存在有規(guī)律的波動，其規(guī)律為:ilexsaponin A1在5-7月出現(xiàn)全年含量的最低值，在9月出現(xiàn)含量最大值，ilex

9、saponinB1在一年中會出現(xiàn)兩次含量高峰，一次出現(xiàn)在5-7月，另一次出現(xiàn)在11月。DP002和DP003兩個樣本中ilexsaponin A1，ilexsaponin B1含量的變化趨勢基本一致。
　　結(jié)論:
　　基于ISSR分子鑒定的研究結(jié)果顯示，本實驗篩選出的11條引物能夠?qū)⒚嗪投d毛冬青進行明顯區(qū)分，證明兩者在分子水平上存在差異，結(jié)合前人化學研究，有必要對禿毛冬青能否入藥毛冬青進行深入研究。建立了毛冬青ISSR指