1、分類(lèi)號(hào)密級(jí)UDC編號(hào)碩士學(xué)位論文減毒沙門(mén)菌介導(dǎo)的HNP3基因在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)及其抗菌活性研究學(xué)位申請(qǐng)人：人：陳慧敏指導(dǎo)教師：師：李銀聚教授學(xué)科專(zhuān)業(yè)：業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)位類(lèi)別：別：理學(xué)2014年4月I論文題目：論文題目：減毒沙門(mén)減毒沙門(mén)菌介導(dǎo)的菌介導(dǎo)的HNP3基因在基因在真核細(xì)胞真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)表達(dá)及其抗菌活性研究及其抗菌活性研究專(zhuān)業(yè)：業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究生：生：陳慧敏陳慧敏指導(dǎo)教師：指導(dǎo)教師：李銀聚李銀

2、聚教授教授摘要鼠傷寒沙門(mén)菌是一種能夠在體內(nèi)多種組織定植的胞內(nèi)侵襲性細(xì)菌。經(jīng)消化道感染的鼠傷寒沙門(mén)菌可寄居在肝臟、腎臟、淋巴結(jié)和肺臟等組織器官，這種特性決定了鼠傷寒沙門(mén)菌可作為理想的外源基因的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，經(jīng)減毒的鼠傷寒沙門(mén)菌可作為理想的質(zhì)粒DNA運(yùn)載載體。人α防御素3（HNP3）是一種陽(yáng)離子抗菌肽，存在于哺乳動(dòng)物的大部分組織器官中，是機(jī)體先天性免疫的重要組成部分。HNP3抗菌譜廣，對(duì)多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、真菌、寄生蟲(chóng)以及包膜病毒等

3、都有較強(qiáng)的殺滅作用。因此，針對(duì)HNP3開(kāi)展分子結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)性研究具有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)HNP3的編碼序列設(shè)計(jì)3對(duì)引物，分別擴(kuò)增HNP3的原前體肽（preproHNP3）、前體肽（proHNP3）和成熟肽（HNP3）基因片段，構(gòu)建原前體肽和成熟肽真核表達(dá)載體pcDNA(preproHNP3)和pcDNA(HNP3)及前體肽原核表達(dá)載體PYA(proHNP3)。然后將重組真核表達(dá)載體pcDNA(preproHNP3)和pcDNA(HN

4、P3)電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入減毒沙門(mén)菌ΔcrpSL1344，重組原核表達(dá)載體PYA(proHNP3)電轉(zhuǎn)化入減毒沙門(mén)菌ΔcrpΔasdSL1344，構(gòu)建重組菌?crpSL1344(pcDNApropreHNP3)、?crpSL1344(pcDNAHNP3)和?crp?asdSL1344(PYAproHNP3)。重組菌分別轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的BHK細(xì)胞，TricineSDSPAGE和Westernbloting檢測(cè)preproHNP3、HNP3和proHN

5、P3蛋白表達(dá)情況，ELISA檢測(cè)其表達(dá)水平，瓊脂板擴(kuò)散法檢測(cè)表達(dá)的preproHNP3、HNP3和proHNP3的抗菌活性；在此基礎(chǔ)上，重組菌分別接種昆明白小鼠，于接種后第10d用沙門(mén)菌SL1344標(biāo)準(zhǔn)毒株和野生型大腸桿菌進(jìn)行攻毒保護(hù)性試驗(yàn)。結(jié)果顯示：重組菌?crpSL1344(pcDNApreproHNP3)、?crpSL1344(pcDNAHNP3)和?crp?asdSL1344(PYAproHNP3)在BHK細(xì)胞中分別有10.0k