1、獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過(guò)的研究成果，也不包含為獲得安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過(guò)的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示謝二￡E√恩0學(xué)位論文作者簽名：竺咝簽字日期：2012年5月30目學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)

2、保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子文件，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文(保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書)。學(xué)位論文作者簽名：爹磁指導(dǎo)教師簽名：簽字日期：2012年5月30日簽字日期：2012年5月30日于葡晏植原體免疫主導(dǎo)膜蛋白(Imp)是植原體免疫膜蛋白系統(tǒng)中重要的成員，

3、在植原體傳播、致病的過(guò)程中可能起著關(guān)鍵的作用。對(duì)植原體膜蛋白組的研究，可探尋植原體致病機(jī)理，：另通過(guò)免疫獲得植原體各膜蛋白特異性抗體可制備高通量蛋白質(zhì)檢測(cè)芯片。本實(shí)驗(yàn)開(kāi)展了原核誘導(dǎo)表達(dá)Imp，親和層析純化目的蛋白以及Imp多克隆抗體制備等一系列：工作。本研究以重組克隆質(zhì)粒pMDl8Timp為模板，利用含NdeI、XhoI酶切位點(diǎn)的引物PCR擴(kuò)增Imp基因片段，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET28a()imp，轉(zhuǎn)化宿主菌EcoliBL21(DE3)

4、。PCR、雙酶切及測(cè)序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pET28a()imp構(gòu)建成功。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)、SDSPAGE電泳分析，重組菌BL21(pET28a()imp)表達(dá)出大小約20kD的蛋白，與預(yù)期的攜帶6HisTag的目的蛋白(195rD)大小相符。Westernblotting檢測(cè)HisTag，結(jié)果顯示帶有6HisTag的Imp融合蛋白在大腸桿菌中能夠成功表達(dá)?？扇苄苑治鲲@示，表達(dá)的Imp融合蛋白在大腸桿菌體系內(nèi)以可溶蛋白和包涵體兩種形式存在，主

5、要為包涵體蛋白。重組菌BL21(pET28a()imp)培養(yǎng)條件正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，最佳培養(yǎng)條件參數(shù)為：溫度37。C，pH70，裝液量20％。重組菌培養(yǎng)8h達(dá)到穩(wěn)定期。根據(jù)方差分析，一定的范圍內(nèi)，培養(yǎng)溫度對(duì)重組菌生長(zhǎng)影響最顯著，各因素影響主次為：溫度裝液量pH。誘導(dǎo)條件正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，最佳誘導(dǎo)條件組合為：溫度37。C，起始OD600≈15，IPTG終濃度01mmol／L，誘導(dǎo)培養(yǎng)6h。根據(jù)方差分析，誘導(dǎo)溫度與誘導(dǎo)起始OD600值對(duì)Imp

6、的表達(dá)量影響最顯著，各因素影響主次為：誘導(dǎo)溫度誘導(dǎo)起始OD600值誘導(dǎo)時(shí)間IPTG終濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示誘導(dǎo)物IPTG與目的蛋白表達(dá)對(duì)重組菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，菌體的生長(zhǎng)量與融合蛋白的表達(dá)量呈線性相關(guān)。以優(yōu)化條件發(fā)酵重組菌，融合蛋白Imp的表達(dá)量約為70mg／L。原核表達(dá)載體pET28a()表達(dá)的融合蛋白帶有6HisTag，Ni—NTAHisBind樹脂作為親和材料純化融合蛋Imp。200ml發(fā)酵菌體裂解液與lml的樹脂結(jié)合，使用8ml含40

7、mg咪唑的洗滌緩沖液可除去絕大部分雜蛋白，4ml含300mM咪唑的洗脫緩沖液可基本洗脫目的蛋白。研究表明以包涵體為材料，變性條件下純化獲得較高濃度與純度的Imp蛋白。純化的可溶性蛋白透析脫咪唑，濃縮獲得08mg／mlImp蛋白溶液，純度95％。將純化的融合蛋白免疫家兔后，成功獲得了兔抗Imp多克隆抗體。間接ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)為1：128，000，Westernblotting分析制備的多克隆抗體與Imp蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。關(guān)鍵詞：