a型重組相思豆毒素A、B鏈蛋白的原核表達(dá)、純化及其生物活性分析.pdf_第1頁
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1、為提高相思豆毒素A鏈(ABRaA)的表達(dá)量,根據(jù)E. coli對(duì)密碼子的偏好性,設(shè)計(jì)并合成相互重疊的24條長(zhǎng)片段寡核苷酸引物,以兩步PCR法合成了優(yōu)化的ABRaA片段,并克隆到pGEM-T載體中,測(cè)序結(jié)果正確后,亞克隆至pMBP-p、pET-Dsba、pET-Trx和pET-His系列載體,分別構(gòu)建了分泌型、融合型、非融合型三種類型的原核表達(dá)載體.轉(zhuǎn)化E.coli受體細(xì)胞中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),均有目的蛋白表達(dá),其中有兩種是可溶性表達(dá),但尤

2、以非融合型pET-HisA載體表達(dá)最成功,可溶性目的蛋白占菌體總蛋白30﹪左右.借助表達(dá)蛋白帶有6×His標(biāo)簽的特性,采用固相化Ni-NTA親和層析柱對(duì)重組相思豆毒素A鏈(rABRaA)蛋白進(jìn)行一步純化,洗脫峰中目的蛋白的純度高達(dá)98﹪左右.Western印跡分析證明,rABRaA可以與兔抗天然abrin抗體發(fā)生特異性的結(jié)合反應(yīng).純化的rABRaA蛋白作用于大鼠肝rRNA,經(jīng)苯胺處理后,能使rRNA釋放出一段420bp左右的特征性寡核苷

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