1、溫州醫(yī)學院碩士學位論文EBVLMP2A基因慢病毒載體質粒的構建及體外表達、鑒定姓名：張琴申請學位級別：碩士專業(yè)：病原生物學指導教師：夏克棟張麗芳20100501溫州醫(yī)學院碩I：學位論文9士甲：口木1提取EBV標準株(B958細胞)總RNA，通過RT—PCR獲得了EBVLMP2A編碼區(qū)基因序列，經(jīng)測序比對與SwissProt蛋白質數(shù)據(jù)庫(P13285)的序列完全一致。2酶切鑒定和核苷酸測序結果表明，成功構建了含有EBV—LMP2A。?；?/p>

2、序列的原核重組質粒PGEX／EBV—LMP2A。訓。。在37℃，1OmMIPTG作用下誘導5h能很好地表達目的蛋白，經(jīng)SDSPAGE分析相對分子量為50kDa。WesternBlot結果顯示，以His單克隆抗體作為一抗，則可見單一明顯條帶，與SDS—FAGE中位置吻合。用NiNTA樹脂親和層析法純化得到融合蛋白EBV—LMP2AH。。。BALB／c小鼠經(jīng)融合蛋白EBV—LMP2AH。。免疫后，經(jīng)ELISA檢測證實，獲得了具有較高效價的特

3、異性IgG免疫血清。3成功構建了慢病毒重組質粒CFUGW／EBV—LMP2A／EGFP和CFUGW／EBV—LMP2A，轉染COS7細胞后經(jīng)RTPCR檢測，均可檢測到約1500bp大小的片段，與目的基因EBV—LMP2A大小一致。轉染CFUGW／EBV—LMP2A／EGFP的COS一7細胞在熒光顯微鏡下可直接觀察到熒光。轉染CFUGw／EBV—LMP2A的COS一7細胞通過間接免疫熒光的方法在共聚焦顯微鏡下可觀測到熒光。經(jīng)Western

4、Blot分析，上述兩種重組質粒均可轉染COS7細胞表達54Kda的EBVLMP2A蛋白。結論1成功獲得EBVLMP2A編碼區(qū)全產(chǎn)基因序列。2通過分子克隆技術，成功構建了含EBV—LMP2A。。的重組質粒PGEX／EBV—LMP2AH。。，在原核表達系統(tǒng)中表達了含EBVLMP2A。。的融合蛋白，通過親和層析法得到了純化的EBVLMP2AH。。融合蛋白，經(jīng)EBV—LMP2AH。。融合蛋白免疫BALB／c小鼠，獲得了特異性的免疫血清。3通過分