1、獨創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學位論文是本人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得或其他教育機構(gòu)的學位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。學位論文作者簽名：簽字日期：年月日學位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學位論文作者完全了解江西師范大學研究生院有關保留、使用學位論文的規(guī)定，有

2、權(quán)保留并向國家有關部門或機構(gòu)送交論文的復印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)江西師范大學研究生院可以將學位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、匯編學位論文。(保密的學位論文在解密后適用本授權(quán)書)學位論文作者簽名：簽字日期：年月日導師簽名：簽字日期：年月礦；，／。，L▲摘要本文以煙曲霉(AspergiJJusfumigatus)分泌的殼聚糖內(nèi)切酶為研究對象，將其成熟基因成功克隆后，經(jīng)電

3、轉(zhuǎn)化導入畢赤酵母中實現(xiàn)高效表達。殼聚糖內(nèi)切酶是專一性降解殼聚糖生成水溶性殼聚糖與殼寡糖的最理想的生物催化劑，是替代當前普遍采用強酸等化學降解工藝的急需工業(yè)酶。為了實現(xiàn)其高效表達，本文對幾個關鍵問題進行研究，特別注重重組畢赤酵母發(fā)酵條件的優(yōu)化，獲得的研究資料為殼聚糖內(nèi)切酶的生產(chǎn)提供了依據(jù)。第一，研究了殼聚糖內(nèi)切酶基因電轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中的最佳方式。確定了重組畢赤酵母表達載體pPIC9K—Csn經(jīng)SalI線性化后電轉(zhuǎn)化入表達宿主GSl15。第

4、二，研究了多重組子的篩選。采用不同濃度的抗生素G418篩選多重組子，發(fā)現(xiàn)在4mg／mL的G418中篩選多重組子效果較好。經(jīng)PCR分析后表明，殼聚糖內(nèi)切酶基因在GSll5中得到了正確的高效表達。經(jīng)酶活檢測，實驗室搖瓶發(fā)酵時，多重組子在畢赤酵母中表達的酶活最高可達6793U／mL。經(jīng)SDS—PAGE測定，表達產(chǎn)物的分子量為25KD。第三，對重組畢赤酵母發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。經(jīng)過兩個發(fā)酵階段的條件優(yōu)化實驗：(1)生長階段的最佳發(fā)酵工藝為：甘油1

5、096(v／v)，硫酸銨25％(w／v)，Biotin000004％(w／v)，lmol／L磷酸緩沖液10％(v／v)，pH55，在250mL的三角瓶里裝液量為20mL，在30“C，220rpm條件下培養(yǎng)48h，接種量為1％。(2)誘導階段的最佳發(fā)酵工藝為：甲醇05％(v／v)，甘油025％(v／v)，硫酸銨2O％(w／v)，Biotin000004％(w／v)，lmol／L磷酸緩沖液10％(v／v)，pH60，在250mL的三角瓶里裝