1、口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是危害世界各國畜牧業(yè)最嚴(yán)重的疾病之一,其病原是口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV).預(yù)防和控制口蹄疫關(guān)鍵是疫苗和診斷方法.目前用于口蹄疫的診斷技術(shù)有多種,但ELISA是一種最經(jīng)濟(jì)、有效的方法之一.而傳統(tǒng)ELISA需要全病毒作為抗原或制備抗體,生產(chǎn)全病毒需要昂貴的培養(yǎng)基,且存在散毒的危險(xiǎn).一種可供替代的方法是將型特異性序列進(jìn)行體外表達(dá)

2、,用表達(dá)產(chǎn)物作為檢測用抗原.此外,目前研究發(fā)現(xiàn)α/β干擾素對口蹄疫有很好的抗病毒效果.該研究擬從以下兩個(gè)方面進(jìn)行:1.口蹄疫病毒VP1基因C末端串連表達(dá)及其抗體ELISA方法的初步建立 參照Taiwanse97(AJ294928)設(shè)計(jì)了一對特異性引物,從pcDNA-P1中克隆出VP1基因C末端,包括B細(xì)胞表位(141-160aa)和T細(xì)胞表位(200-213aa)序列分析表明:其C末端長285bp,編碼74個(gè)氨基酸,與O/HKN/12/

3、91、O/PEN/TAW/99核苷酸和氨基酸同源性分別為95﹪、93﹪和96﹪、93﹪;利用同尾酶XhoⅠ、SalⅠ將VP1基因C末端串聯(lián)起來;再將單拷貝和雙拷貝C末端基因插入到原核表達(dá)載體pGEX-KG后,轉(zhuǎn)化BL21(DE3),在IPTG誘導(dǎo)下獲得表達(dá),經(jīng)Western blotting檢測證實(shí)表達(dá)產(chǎn)物具有活性.以表達(dá)產(chǎn)物包被ELISA板,初步建立了特異、敏感的ELISA診斷方法.同時(shí)用表達(dá)產(chǎn)物免疫BABL/c小鼠,能產(chǎn)生一定的抗O

4、型口蹄疫病毒的抗體.該研究將在研制新型疫苗和建立診斷方法等方面具有潛在的理論價(jià)值和應(yīng)用前景.2.梅山豬α/β干擾素的克隆、定點(diǎn)誘變及原核表達(dá) 利用PCR技術(shù)從中國梅山豬白細(xì)胞總DNA中擴(kuò)增出α/β干擾素基因(MS-IFNα/β),將PCR產(chǎn)物克隆至pMD18-T載體,利用雙脫氧末端終止法測定了全基因的核苷酸序列.序列分析表明:β干擾素基因全長561bp,編碼186個(gè)氨基酸,與GenBank中S41178的序列同源性達(dá)到99﹪,在128、

5、177位核苷酸處發(fā)生了點(diǎn)變異,由G變?yōu)锳,T變?yōu)镃;但僅導(dǎo)致43位氨基酸由G變?yōu)镋;豬干擾素(MS-IFNα)全長570bp,編碼189個(gè)氨基酸的前體蛋白,其中含23個(gè)氨基酸的信號(hào)肽和166個(gè)氨基酸的成熟多肽,成熟多肽中含5個(gè)半胱氨酸,與GenBank中M28623的序列同源性為96﹪.通過巨引物法,分別對MS-IFNα基因(第86位氨基酸)和MS-IFNβ基因(第17位氨基酸)進(jìn)行定點(diǎn)誘變.在此基礎(chǔ)上,通過PCR方法將編碼成熟蛋白基因