1、內(nèi)蒙古大學博士學位論文人gdnf在牛胎兒成纖維細胞βcasein基因座的定位整合及基因打靶克隆囊胚的制備姓名：張學明申請學位級別：博士專業(yè)：動物學指導教師：吳應積20090330摘要包括啟動子、外顯子1、內(nèi)含子1和部分外顯子2的22kb調(diào)控序列和下游57kb序列為57和3’同源臂；neo抗性基因為正篩選因子，位于兩同源臂之間；HSVtk基因和DsRed2基因為雙負篩選因子，分別位于57和3’同源臂外側；人砌_f基因置于5’同源臂下游，S

2、V40polyA序列插入到人gdnf軀]下游作為人砌廛因轉錄終止信號。經(jīng)PCR檢測、限制性內(nèi)切酶圖譜及DNA測序分析結果表明，所構建載體結構正確。2打靶載體pNRTCNbG的生物學功能分析為了檢測打靶載體pNRTCNbG的生物學功能，用脂質(zhì)體介導法將其導入人乳腺腫瘤上皮細胞系Bcap37細胞中，經(jīng)G418抗性篩選810天后，獲得了表達紅色熒光蛋白的穩(wěn)定轉染pNRTCNbG的人乳腺上皮細胞單克隆。將單克隆細胞擴大培養(yǎng)后，經(jīng)PCR檢測結果表

3、明，生f=flcasein基因啟動子驅動的)＼gdnf基因已整合到表達紅色熒光蛋白的人乳腺上皮細胞中。用催乳素、胰島素及氫化可的松誘導培養(yǎng)轉基因細胞，經(jīng)RTPCR和WesternBlot檢測表明，牛flcasein基因啟動子驅動的^礎陛因能夠在人乳腺上皮細胞中轉錄翻譯并分泌到胞外。這些結果表明，我們構建的人薊夥基因在牛flcasein基因座定位整合載體pNRTCNbG具有生物學功能，同時也表明人乳腺腫瘤上皮細胞系Bcap37能夠用于乳腺