1、該研究做了二方面的工作：一方面利用Tn5gusA5隨機誘變方法,對慢生型大豆根瘤菌22-10的染色體進行了插入誘變,篩選到抗春雷霉素（ksg<'r>）突變體6株.根據(jù)已知的Tn5gusA5序列,設計引物,經(jīng)PCR檢測,結(jié)果表明突變體染色體DNA上并無Tn5gusA5的插入,推測抗春雷霉素突變株為自發(fā)突變.另一方面,從NCBI Genebank Blast中查到根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）、苜蓿中華根瘤

2、菌（Sinorhizobium meliloti）、百脈根中慢生根瘤菌（Mesorhizobium loti）的春雷霉素敏感基因（ksgA）序列,經(jīng)alignment（對齊）分析,選擇高度保守區(qū),設計引物.以慢生型大豆根瘤（B.japonicum）22-10的總DNA為模板,擴增出長度為520bp的DNA片段.通過NCBI Gene Bank Blast分析,表明它與已發(fā)表的Agrobacterium、Mesorhizobium和Sin

3、orhizobium的ksgA基因具有相當高的一致性,說明擴增的520bp產(chǎn)物是慢生型大豆根瘤菌22-10的ksgA基因的部分片段.然后利用Tail-PCR方法擴增出520bp片段的兩側(cè),獲得一長度為1598bp的DNA片段,其內(nèi)含一個完整的ORF（開放閱讀框架）,該ORF長度為858bp,命名為B.jksgA.Blastx分析結(jié)果表明其氨基酸一級結(jié)構(gòu)與已報道的苜蓿中華根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）的ksgA基因

4、的氨基酸同源性高達69﹪.初步認為已擴增的858bp的ORF是慢生型大豆根瘤菌22-10的ksgA基因.根據(jù)已知的含有B.jksgA基因的1598bp DNA序列,設計引物PCR擴增B.jksgA基因的ORF的兩側(cè)序列,左側(cè)為395bp,右側(cè)為345bp.同時從質(zhì)粒載體上PCR擴增Km<'r>基因的ORF.將左側(cè)395bp、Km<'r>基因的ORF、右側(cè)345bp混合后,加入左側(cè)片段的正向引物和右側(cè)片段的反向引物進行PCR連接,獲得B

5、.jksgA基因缺失結(jié)構(gòu)體（LksgA）.將LksgA結(jié)構(gòu)體連接到pIJ3200上,得到重組質(zhì)粒pIJ32LksgA,電脈沖轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化B.japonicum 22-10,以進行同源雙交換,利用pIJ3200（pLAFR系列）與pPH1JI質(zhì)粒的不相容性,趕走pIJ32LksgA質(zhì)粒,選擇Rif抗體、Km抗性及春雷霉素抗性（ksg<'r>）,獲得B.jksgA基因置換突主體4株,PCR驗證結(jié)果表明4株突變體的ksgA基因已被LksgA結(jié)構(gòu)