1、桑樹是多年生的重要經(jīng)濟(jì)作物，屬?？粕?，是家蠶的唯一飼料。桑樹經(jīng)長(zhǎng)期的自然選擇和人工選育，形成了豐富的桑樹種質(zhì)資源。但是，與其它植物相比我們?cè)谏涔δ芑蜓芯康确矫娑继幱诼浜鬆顟B(tài)。因此，研究桑樹一些重要的基因及其脅迫環(huán)境下的分子作用機(jī)制，有利于提高桑葉產(chǎn)量及桑樹資源的培養(yǎng)和保存。
　　本文通過(guò)抑制消減雜交技術(shù)和同源性基因克隆獲得了桑樹的3個(gè)差異顯著的ESTs序列，并根據(jù)獲得的序列結(jié)合RT-PCR和RACE技術(shù)克隆得到了2個(gè)基因的全

2、長(zhǎng)cDNA序列。利用脅迫誘導(dǎo)和熒光定量PCR的方法對(duì)2個(gè)基因進(jìn)行功能驗(yàn)證和表達(dá)分析。同時(shí)從桑樹中克隆出了ANS基因序列，經(jīng)過(guò)酶切、連接到表達(dá)載體1302上，為以后轉(zhuǎn)到擬南芥上進(jìn)行功能研究做準(zhǔn)備。本文主要研究?jī)?nèi)容如下：
　?。?）桑樹紫芽與綠芽的消減抑制雜交
　　花青素與桑樹嫩芽的顏色表現(xiàn)有關(guān)，桑樹中與花青素合成及調(diào)節(jié)相關(guān)的基因很多，本文以桑樹紫芽與綠芽為材料，進(jìn)行消減抑制雜交。所得雜交產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳得到差異條帶群，可

3、以看到差異顯著的三個(gè)條帶，進(jìn)行回收測(cè)序，得到其中2條條帶的EST序列。獲得的EST序列經(jīng)Blast比對(duì)和同源性分析，其中一條可能與花青素有關(guān)。
　?。?）桑樹兩個(gè)花青素相關(guān)基因的全長(zhǎng)克隆及脅迫情況下的表達(dá)分析
　　從消減抑制雜交中獲得的EST序列和從已構(gòu)建的桑樹幼葉cDNA文庫(kù)得到了一個(gè)與花青素相關(guān)基因CHS3的一段序列，通過(guò)RACE與RT-PCR結(jié)合的方法獲得了兩個(gè)基因的全長(zhǎng)，并命名為 Ma-TCTP（基因登錄號(hào)：KP22

4、8013）和Ma-CHS3。序列分析表明，Ma-TCTP該基因cDNA全長(zhǎng)841bp，包括101bp的5′-UTR、233bp的3′-UTR，ORF為507bp,編碼168個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為18.7362kD,等電點(diǎn)為4.53。同源分析表明，Ma-TCTP基因在各物種間具有很高的保守性。Ma-CHS3該基因cDNA全長(zhǎng)1234bp，包括215bp的3′-UTR，ORF為1017 bp，編碼338個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為36.7

5、018kD，等電點(diǎn)為7.58。同源性分析表明，該基因與CHS同族基因序列相似性很高。
　　花青素相關(guān)基因不僅與顏色有關(guān)，還與植物的抗逆性有關(guān)，定量PCR結(jié)果表明，Ma-TCTP和Ma-CHS3基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平在不同組織及低溫、高溫脅迫下的均有所不同，但其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。
　?。?）桑樹ANS基因的表達(dá)載體構(gòu)建
　　從NCBI中已經(jīng)得到的ANS序列，設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的引物，通過(guò)RT-PCR從桑樹中得到ANS