1、家蠶是鱗翅目昆蟲的模式生物，也是重要的遺傳研究模型。家蠶質(zhì)型多角體病毒（Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus,BmCPV）是家蠶主要病毒病原之一，可以引起家蠶群體內(nèi)中腸型膿病的發(fā)生。迄今為止，國內(nèi)外有關(guān)家蠶對(duì)BmCPV的防御機(jī)制的研究報(bào)道較少，養(yǎng)蠶生產(chǎn)上對(duì)中腸型膿病的防治也僅是以預(yù)防為主。不同家蠶品種對(duì)BmCPV感染的抵抗性有一定的差異，但尚未培育出抗BmCPV的家蠶品種。為了從分子水平上

2、探索家蠶抵抗BmCPV感染的防御機(jī)制和不同家蠶品種對(duì)BmCPV的免疫調(diào)控機(jī)理，我們前期通過高通量測(cè)序技術(shù)分析篩選了家蠶品種4008（BmCPV易感）和P50（BmCPV抗性）在感染BmCPV后的差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)家蠶中腸的類胰島素相關(guān)肽結(jié)合蛋白2（Bombyx mori insulin-related peptide-binding protein,BmIBP2）基因的表達(dá)水平明顯上調(diào)，且在抗性品種中的上調(diào)表達(dá)倍數(shù)高于易感品種，生物信息

3、學(xué)分析推測(cè)IBP基因與細(xì)胞凋亡及免疫防御有關(guān)，因此推測(cè)BmIBP2參與了家蠶抵抗BmCPV感染的防御機(jī)制。本研究成功表達(dá)了BmIBP2的重組蛋白rBmIBP2，研究該蛋白對(duì)家蠶細(xì)胞增殖的影響，并采用RNA干涉及過表達(dá)技術(shù)研究了BmIBP2基因的功能，進(jìn)一步鑒定獲得一個(gè)BmIBP2的互作蛋白。得到的主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　1.BmIBP2基因在BmCPV和其它幾種病原侵染家蠶中腸中的差異表達(dá)
　　通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT

4、-PCR）技術(shù)檢測(cè)了家蠶感染質(zhì)型多角體病毒（BmCPV）、核型多角體病毒（BmNPV）、二分濃核病毒（BmBDV）、球孢白僵菌（Beauveria bassina）、家蠶微孢子蟲（Nosema bombycis）后不同時(shí)間點(diǎn)中腸組織中BmIBP2的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BmIBP2基因不僅在BmCPV感染的家蠶中腸上調(diào)表達(dá)，在其他病原感染的家蠶中腸，也發(fā)生一定的差異表達(dá)，說明該基因參與了家蠶對(duì)病原感染的應(yīng)答與防御過程，并且具有重要的免疫防御

5、功能。
　　2.BmIBP2蛋白對(duì)家蠶培養(yǎng)細(xì)胞增殖的影響
　　首先通過原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)BmIBP2基因進(jìn)行重組表達(dá)，對(duì)表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行純化復(fù)性后添加入家蠶BmN細(xì)胞培養(yǎng)基中，通過MTT法檢測(cè)該純化蛋白對(duì)BmN細(xì)胞增殖的影響，并檢測(cè)了蛻皮激素20E對(duì)BmIBP2基因的調(diào)控作用。結(jié)果表明，純化的重組蛋白rBmIBP2對(duì)家蠶BmN細(xì)胞的增殖具有一定的抑制作用，并且20E能夠促進(jìn)家蠶細(xì)胞中BmIBP2的表達(dá)。
　　進(jìn)一步通過R

6、NAi和基因過表達(dá)技術(shù)探索了BmIBP2基因的功能。采用化學(xué)合成法合成了BmIBP2基因的siRNA及negative control siRNA，轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞，檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖的影響，同時(shí)檢測(cè)BmIBP2基因及糖代謝相關(guān)呼吸酶基因的表達(dá)變化情況。RNAi實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BmIBP2基因被干擾沉默后，與對(duì)照組相比，BmIBP2基因呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，家蠶BmN細(xì)胞增殖速度加快，同時(shí)檢測(cè)到糖代謝相關(guān)呼吸酶基因呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)。同時(shí)，我們構(gòu)建了轉(zhuǎn)

7、基因表達(dá)載體pIZT-IBP2對(duì)BmIBP2基因進(jìn)行過表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比家蠶BmN細(xì)胞增殖速度減慢，并且糖代謝呼吸酶相關(guān)基因呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)。
　　3.BmIBP2互作蛋白的篩選與鑒定
　　利用Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)將BmIBP2和EGFP在家蠶細(xì)胞中進(jìn)行融合表達(dá)，其中EGFP基因作為報(bào)告基因，經(jīng)同源重組獲得vBmEGFP-IBP2重組桿狀病毒穿梭質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞并用SDS-PAGE和Western-blo

8、t方法檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組蛋白成功表達(dá)，大小約為55kDa。隨后收集蛋白并利用EGFP作為抗原決定簇通過免疫共沉淀技術(shù)篩選與BmIBP2蛋白相互作用的宿主細(xì)胞蛋白。通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，我們篩選到一個(gè)與BmIBP2有相互作用的蛋白，經(jīng)質(zhì)譜鑒定為家蠶ATP合成酶（Bombyx mori ATP synthase）。經(jīng)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，家蠶類胰島素相關(guān)肽結(jié)合蛋白2與家蠶ATP合成酶之間的確存在相互作用。
　　上述研究結(jié)果不