1、羅漢果花葉病毒嚴(yán)重影響羅漢果的產(chǎn)量，通過轉(zhuǎn)基因獲得抗病毒品種是防治羅漢果病毒病最有效的途徑，轉(zhuǎn)基因技術(shù)和RNAi技術(shù)的日漸成熟為培育抗花葉病毒轉(zhuǎn)基因羅漢果奠定了基礎(chǔ)。小西葫蘆黃化花葉病毒（Zucchiniyellow mosaic virus, ZYMV）是羅漢果花葉病的主要病原病毒，分布較廣、危害較重。為了針對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐中普遍發(fā)生的花葉病毒培育具有生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值的抗病毒羅漢果品種，本研究以規(guī)模種植羅漢果基地的花葉病發(fā)病植株為基因克隆的實(shí)驗(yàn)

2、材料。為了提高RNA干擾羅漢果花葉病毒復(fù)制的效率，把感染羅漢果的花葉病毒多個(gè)功能基因片段串聯(lián)起來作為RNAi目標(biāo)片段，轉(zhuǎn)化羅漢果，從而建立一個(gè)穩(wěn)定高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系，利用基因工程策略獲得對(duì)花葉病毒具有廣譜抗性的抗花葉病毒羅漢果植株。
　　本研究?jī)?yōu)化了羅漢果組織培養(yǎng)擴(kuò)繁的條件，最適外植體為莖尖，芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為 MS+6-BA0.5 mg/L+NAA0.05 mg/L，誘導(dǎo)率為97.5％；繼代培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5 mg/L+I

3、BA0.1 mg/L+GA30.1 mg/L，增殖率為9；通過葉片再生實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：葉片誘導(dǎo)再生苗的培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0 mg/L+IBA0.5 mg/L+TDZ0.05 mg/L，出芽系數(shù)達(dá)10.68，為抗病毒羅漢果轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)提供充足的材料。
　　本文研究了羅漢果組培苗的莖段、葉柄及葉片不同類型的外植體的再生能力，結(jié)果表明，葉片的再生率明顯高于葉柄和莖段，是羅漢果遺傳轉(zhuǎn)化最佳外植體的選擇。同時(shí)對(duì)羅漢果遺傳轉(zhuǎn)化的條件進(jìn)行優(yōu)

4、化，研究結(jié)果表明：預(yù)培養(yǎng)1d、菌液濃度的OD值為0.2、外植體與農(nóng)桿菌侵染15 min、共培養(yǎng)4 d、抗生素羧芐霉素的濃度為200 mg/L、篩選劑G418濃度以40 mg/L作為篩選壓力的轉(zhuǎn)化率最高。
　　本研究將ZYMV的Hc-pro，NIa，NIb，CP基因和3?UTR區(qū)多個(gè)基因片段串聯(lián)構(gòu)成RNAi的目標(biāo)序列，獲得的目的片段克隆到可以形成RNAi莖環(huán)結(jié)構(gòu)的中間載體pXQ中，形成RNAi結(jié)構(gòu)片段。通過PCR鑒定陽(yáng)性克隆，最終獲