1、肉堿棕櫚酰轉移酶Ⅰ(CPTⅠ)是線粒體脂肪酸β-氧化的一種“限速酶”，它在脊椎動物中控制長鏈脂肪酸的β氧化，在降解脂肪過程中發(fā)揮著重要作用。近年來，哺乳動物中對于CPTⅠ基因的結構和功能的研究取得了一定程度的進展。但是卻很少有對魚類CPTⅠ基因研究和酶學性質的相關報道，也沒有任何研究涉及外源營養(yǎng)素對魚類CPTⅠ基因表達和動力學性質的影響。鋅是魚類一種必需的微量元素，它的存在維系著魚類生理發(fā)育的不同功能。迄今大量的學者研究了鋅對魚類生長、

2、金屬富集、氧化應激和組織病變等方面的影響，但是很少有學者關注鋅對魚類脂代謝的影響。本論文克隆了矛尾復蝦虎魚（Javelingoby,Synechogobiushasta）和黃顙魚（yellowcatfish，Pelteobagrusfulvidraco）CPTⅠ的全長cDNA序列，并對其結構、進化、表達和動力學性質進行了研究。同時從CPTⅠ的基因表達和動力學的角度探討了水體和飼料鋅水平對CPTⅠ的影響機制。
　　論文的主要研究結果

3、和結論如下:
　　1矛尾復蝦虎魚CPTⅠ的克隆與動力學性質的研究
　　在脊椎動物中，CPTⅠ的調(diào)節(jié)在控制脂肪酸代謝方面起著重要的作用。在當前的研究中，我們克隆了蝦虎魚CPTⅠ的cDNA全序列，分別為CPTⅠα1a-1a、CPTⅠα1a-1b、CPTⅠα1a-1c、CPTⅠα1a-2、CPTⅠα2a、CPTⅠα2b1a、CPTⅠα2b1b和CPTⅠβ。進化分析顯示:CPTⅠ基因的重復形成CPTⅠα和CPTⅠβ，CPTⅠα基因的

4、重復形成CPTⅠα1和CPTⅠα2，CPTⅠα2基因進一步重復形成CPTⅠα2a和CPTⅠα2b，CPTⅠα2b基因重復導致CPTⅠα2b1a和CPTⅠα2b1b的產(chǎn)生。CPTⅠα1a基因的選擇性剪切形成4種CPTⅠ剪切突變體，分別為CPTⅠα1a-1a、CPTⅠα1a-1b、CPTⅠα1a-1c和CPTⅠα1a-2。CPTⅠ氨基酸序列比對和跨膜域分析表明蝦虎魚出現(xiàn)了關鍵氨基酸的替換和跨膜域的變化。關鍵氨基酸的替換和跨膜域的改變可能影響

5、CPTⅠ對丙二酸單酰輔酶A(M-CoA)的敏感性或者CPTⅠ的催化活性，賦予魚類CPTⅠ新的酶學性質。
　　為了深入了解蝦虎魚CPTⅠ酶學性質，我們分離了肝臟、心臟、肌肉、腸道和脾臟的線粒體，然后采用酶動力學的方法測定了Michaelis-Menten常數(shù)Km和最大反應速率Vmax。結果顯示:CPTⅠ適宜的反應溫度是34-40℃，最佳pH是7.4，適宜的孵育時間是5-25min，適宜的線粒體蛋白濃度為120μg/ml。蝦虎魚CPT

6、Ⅰ的動力學分析符合Michaelis-Menten規(guī)律。肉堿Km值在肌肉中最高，在其它組織中沒有顯著差異。棕櫚酰輔酶A(P-CoA)的Km值在肝臟中最高，在肌肉中最低，在其它組織中沒有顯著差異。催化效率(Vmax/Km)在心臟中最高，在肝臟中最低。綜上所述，我們的結果表明了不同組織中的CPTⅠ動力學的差異可能反映了脂肪酸氧化的能力。蝦虎魚肝臟最低的CPTⅠ催化效率可能是蝦虎魚易形成“脂肪肝“的一種重要原因。
　　2黃顙魚CPTⅠ的

7、克隆與表達的研究
　　在當前的研究中，采用逆轉錄PCR和快速擴增cDNA末端(RACE)的方法，我們成功克隆得到了黃顙魚CPTⅠ4種構型的cDNA全序列。根據(jù)進化關系，我們命名為CPTⅠα1b、CPTⅠα1a、CPTⅠα2a和CPTⅠβ。CPTⅠ的進化分析暗示黃顙魚CPTⅠα1a和CPTⅠα1b的產(chǎn)生可能是由于CPTⅠα1基因的倍增。CPTⅠα2僅存在魚類中，可能是CPTⅠα的一種亞家族。由于哺乳動物僅有一個單拷貝的CPTⅠα基因

8、，因此我們的結果暗示黃顙魚多重的CPTⅠ基因拷貝可能源于魚類特異性的基因組倍增事件。另外，我們將黃顙魚CPTⅠ的氨基酸序列和其它物種進行比對，結果表明黃顙魚出現(xiàn)了關鍵氨基酸的替換，例如Asp17，Val19，Ser24和Ala275。這些氨基酸同樣出現(xiàn)在其它魚類中，顯示了和哺乳動物巨大差異。我們進一步采用Tmpred軟件分析了黃顙魚CPTⅠ的跨膜域，結果顯示CPTⅠα1a和CPTⅠα1b的氮端比哺乳動物CPTⅠα的更短，但是兩個跨膜域之

9、間的環(huán)狀結構比哺乳動物CPTⅠα的更長。關鍵氨基酸的替換和跨膜域的改變可能影響CPTⅠ對M-CoA的敏感性或者CPTⅠ的催化活性，賦予魚類CPTⅠ新的酶學性質。
　　同時，我們通過熒光定量的方法分析了黃顙魚4種CPTⅠ構型在肝臟、肌肉、心臟、腸道、鰓、腦、脾臟和腎臟中的mRNA表達水平。結果顯示，4種構型均在上述組織中表達，但是有量的差異。CPTⅠα1a和CPTⅠβ傾向于在心臟和肌肉中表達，CPTⅠα1b和CPTⅠα2a的mRNA

10、水平分別在肝臟和鰓中表達最高。我們進一步通過相同的方法檢測了4種CPTⅠ構型在黃顙魚仔魚，幼魚和成魚肝臟、心臟和肌肉中的表達水平。結果顯示構型的轉變貫穿于黃顙魚的整個發(fā)育階段。4種構型的共表達和發(fā)育的構型轉換暗示了魚類更加復雜的脂肪的利用，可能有助于不同組織中脂肪酸氧化的精準控制。
　　3黃顙魚CPTⅠ動力學性質的研究
　　為了深入了解黃顙魚CPTⅠ動力學性質，我們分離了肝臟、心臟、肌肉、腸道和脾臟的線粒體，然后采用酶動力學

11、的方法測定了Michaelis-Menten常數(shù)Km和最大反應速率Vmax。結果顯示:CPTⅠ的最適的反應溫度是36℃，最佳pH是8，適宜的孵育時間是3-20min，適宜的線粒體蛋白濃度為25-200μg/ml。黃顙魚CPTⅠ的動力學分析符合Michaelis-Menten規(guī)律。肉堿Km值在腸道中最高，在脾臟中最低。反之，P-CoA的Km值在脾臟中最高，在腸道中最低。肝臟和心臟具有最大的Vmax值，肌肉和脾臟具有最低的Vmax值。相似地

12、，催化效率(Vmax/Km)在肝臟和心臟中最高，在肌肉中最低。另外，不同組織中的CPTⅠ酶活顯示了和Vmax相似的趨勢。綜上所述，我們的結果表明不同組織中的CPTⅠ動力學的差異可能反映了脂肪酸氧化的能力。在另一方面，與哺乳動物相比，黃顙魚不同組織中Km差異顯得很微弱，可能暗示物種的特異性。
　　4水體慢性和急性鋅暴露對黃顙魚脂肪沉積、肉堿組成、CPTⅠ的表達及其動力學性質的影響
　　本實驗是在Zn2+濃度分別為0.05mgl

13、-1（對照）、0.35mgl-1和0.86mgl-1的水體中對黃顙魚進行為期64d的慢性暴露實驗，和在Zn2+濃度分別為0.05mgl-1（對照）和4.71mgl-1的水體中對黃顙魚進行為期96h的急性暴露實驗，然后研究了水體慢性和急性鋅暴露對黃顙魚生長、脂肪沉積、肉堿組成、CPTⅠ的表達及其動力學性質的影響。慢性和急性鋅暴露對黃顙魚生長有抑制作用。慢性鋅暴露顯著增加了肝臟脂肪的含量(P＜0.05)，相反，急性鋅暴露顯著減少了肝臟脂肪的

14、含量(P＜0.05)，無論是慢性還是急性鋅暴露都顯著減少了肌肉脂肪的含量(P＜0.05)。慢性鋅暴露減少了肝臟Michaelis-Menten常數(shù)Km和最大反應速率Vmax(P＜0.05)，但是在肌肉中兩參數(shù)呈現(xiàn)相反趨勢（Km減少，Vmax增加）。慢性鋅暴露也顯著影響了肝臟游離肉堿(FC)，總肉堿(TC)和酰基肉堿的含量(AC)，但并不影響肌肉各種肉堿組成的含量。慢性和急性鋅暴露也影響了黃顙魚肝臟和肌肉4種CPTⅠ構型的表達，即CPTⅠ

15、a1b、CPTⅠb、CPTⅠa2a和CPTⅠa。進一步分析，我們發(fā)現(xiàn)了構型的表達和Km，以及和Vmax呈現(xiàn)了很好的相關性?？傊?，慢性和急性鋅暴露差異地影響了組織脂肪的沉積，CPTⅠ的動力學性質及其表達水平。該研究提供了鋅暴露影響脂代謝的一種新機制，也加深了我們對魚類鋅毒理的認識。
　　5飼料鋅缺乏和過量對黃顙魚脂肪沉積、肉堿組成、CPTⅠ的表達及其動力學性質的影響
　　黃顙魚分別投喂三種不同鋅水平的飼料20mgkg-1（對照

16、），11.45mgkg-1（缺乏）和155mgkg-1（過量），實驗周期為8周，然后研究了飼料鋅缺乏和過量對黃顙魚生長、脂肪沉積、肉堿組成、CPTⅠ的表達及其動力學性質的影響。結果顯示:鋅水平不能顯著影響黃顙魚生長(P＞0.05)，鋅缺乏傾向增加肝臟和肌肉脂肪的含量(P＞0.05)，但是過量鋅顯著減少了肝臟和肌肉的脂肪含量(P＜0.05)。在肝臟中，鋅缺乏顯著增加了FC，AC和TC的含量(P＜0.05)，但是并不能顯著影響FC/TC和A

17、C/FC的比率(P＞0.05)。鋅過量也顯著增加了TC和AC的含量，但是AC/FC值增加，F(xiàn)C的含量和FC/TC值減少。在肌肉中，鋅缺乏增加了FC的含量，但是鋅過量減少了FC的含量。相似地，鋅缺乏和過量差異地影響了AC/FC和FC/TC的值。鋅缺乏減少了肝臟和肌肉Km和Vmax值，但是鋅過量增加Km和Vmax值。鋅缺乏和過量也影響了黃顙魚肝臟和肌肉4種CPTⅠ構型的表達，即CPTⅠa1b，CPTⅠb，CPTⅠa2a和CPTⅠa。進一步分