1、由鐮刀菌引起的杧果畸形病是杧果生產(chǎn)上的重要病害之一,迄今為止未發(fā)現(xiàn)抗病品種及根治杧果畸形病的有效方法。因而進行病原菌種群分析及其與寄主互作機制的研究,挖掘寄主耐抗病的有效基因,無疑會為抗病育種工作奠定理論基礎。本研究通過營養(yǎng)親和群和ISSR技術分析了我國杧果畸形病病原菌的遺傳多樣性,通過生理生化測定、轉錄組學信息分析探索了杧果與Fusarium mangiferae的互作機制,主要取得以下結果。
　　1、從我國杧果畸形病發(fā)病地采集

2、病組織進行分離,柯赫氏法則驗證后共獲得38個致病菌,經(jīng)形態(tài)學和EF-α延伸因子序列分析鑒定為F.mangiferae。運用VCG和ISSR標記技術對獲得的38個畸形病病原菌進行遺傳多樣性分析。VCG研究結果表明,通過在含KClO3培養(yǎng)基(KPS)上誘導篩選,共獲得抗氯酸鹽、不能利用硝酸鹽營養(yǎng)突變體(nit)455株,通過MM、NM和HM3種不同氮源培養(yǎng)基劃分出nit A、nit B、nit C、nit D四種突變類型,其中nit A出現(xiàn)

3、頻率最高,占總體的78.02％;nit B和nit C其次,分別占7.91%和13.63%;nit D最少,僅占0.44%。采用nit突變體互補型配對技術,將獲得的突變菌株進行配對培養(yǎng),測得不同的營養(yǎng)體親合群(VCGs)數(shù)為5個,其中VCG1內包含30個菌株,3個菌株分布在VCG2內,VCG3和VCG4內各含有2個菌株,菌株MG33單獨形成VCG5。ISSR分子標記結果顯示,供試的38個菌株經(jīng)14條特異性引物共擴增出72條帶,產(chǎn)物條帶介

4、于300-2000 bp,其中52條帶具有多態(tài)性,多態(tài)性比率為72.22%。38個菌株的相似系數(shù)值為0.5972-0.9862,其中菌株MG16和MG17之間的相似系數(shù)最大,為0.9862,菌株MG07和MG33的遺傳相似系數(shù)最小,為0.5972。利用UPGMA法進行聚類分析,在相似系數(shù)為0.76水平上分為5類,33個菌株分布在第Ⅴ類中,MG25和MG35聚合在一起(Ⅳ),菌株MG36(Ⅲ)、MG07(Ⅱ)和MG33(Ⅰ)分別形成單一分

5、支。
　　2、杧果畸形病病原菌生物學特性測定結果表明:供試的38個菌株對杧果的致病力存在一定的差異。病原菌在燕麥培養(yǎng)基上生長速度最快,在液體馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中生長量最大,最佳產(chǎn)孢培養(yǎng)基為馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基;菌絲生長、孢子產(chǎn)生和萌發(fā)的最佳溫度均為25℃-28℃;光照和pH4-10的酸堿度對F.mangiferae菌絲生長速度、孢子產(chǎn)生及萌發(fā)的影響不明顯。F.mangiferae生長的最好碳氮源分別為蔗糖和酵母提取物。菌絲和分子孢子的

6、致死溫度分別是53℃和57℃。毒力測定結果表明:25%咪鮮胺乳油對病原菌菌絲生長的抑制效果最好,EC50和EC95分別為1.2004μg·mL-1和2.6239μg·mL-1;25%嘧菌酯懸浮劑能夠強烈抑制病原菌分生孢子的萌發(fā),EC50和EC95分別為0.5312μg·mL-1和2.9741μg·mL-1。
　　3、杧果與F.mangiferae互作生理機制研究結果表明,①接種病菌后,杧果頂芽內光合色素含量、可溶性總糖、還原性糖、

7、蔗糖和葡萄糖含量均先上升后下降;淀粉和纖維素含量隨著接種時間的延長而不斷下降。在接種病菌初期,中性轉化酶和蔗糖合成酶(合成方向)的活性上升。接種病菌后期,中性轉化酶、蔗糖合成酶(合成方向)和蔗糖磷酸合成酶活性下降,而蔗糖合成酶(分解方向)活性不斷上升。②病菌的侵染能夠引起杧果體內礦質元素含量發(fā)生改變,其中N、K、Fe和Mn的含量隨著接種時間的延長不斷上升,且上升幅度較大,其次是P、Mg、B和Zn,Cu和S的含量變化不明顯,Ca隨著接種時

8、間的延長其含量不斷降低。③可溶性蛋白和RNA含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,接種病菌45d時達到最大。DNA含量呈現(xiàn)不斷上升的趨勢。④F.mangiferae侵染促進杧果頂芽產(chǎn)生速率、H2O2和MDA含量的增加;在F.mangiferae侵染杧果后,谷胱甘肽含量急劇下降,POD、CAT、SOD和GR的活性迅速上升,且在整個測試過程中始終維持在較高水平,而APX活性呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢。⑤接種病菌后,杧果頂芽內赤霉素和生長素含量急速上

9、升,且在整個試驗階段明顯高于對照處理,脫落酸含量在試驗后期不斷升高。⑥病菌侵染對杧果頂芽的酚類代謝也產(chǎn)生了一定的影響,接種病菌45d內,杧果頂芽總酚、類黃酮含量及PAL酶活性均明顯提高,隨后急速下降,PPO活性初期變化不大,后期不斷上升。
　　4、基于Illumina HiSeq 2000平臺,對健康與感病杧果頂芽的轉錄組進行了測序,采用BLAST軟件將獲得的Unigene與nr、Swiss-Prot、KEGG和COG數(shù)據(jù)庫進行比

10、對,基因功能注釋后分析杧果病健組織的差異表達基因(DEGs),并對DEGs進行GO和Pathway富集分析。結果表明,①2個樣品共獲得119,815條Unigene,N50為1546,平均片段長度880bp。經(jīng)RPKM法分析后共獲得29,878個DEGs。以corrected-pvalue≤0.05為閾值的代謝途徑有22條,其中大多數(shù)代謝途徑與植物的抗逆響應密切相關。②153個DEGs參與了淀粉和蔗糖代謝途徑,DEGs主要是編碼糖類異構

11、酶、水解酶和轉移酶等,參與葡糖糖水解、細胞碳水化合物、丙酮酸鹽和核苷酸代謝等生物進程。③在抗氧化生物過程中,編碼活性氧代謝相關酶且差異倍數(shù)在5倍以上的DEGs有24個,19個屬上調表達。表明活性氧代謝在杧果與病原互作過程中起到重要的調解作用。④F.mangiferae侵染杧果后,以差異倍數(shù)在10倍以上為篩選條件,共獲得酚類代謝相關差異表達基因53個,其中40個DEGs上調表達,推測杧果可能是通過合成加固細胞壁的木質素或生成抑菌作用的酚類