1、集簍大學碩士學位論文黃曲霉毒素B 1 翥裂黼其膠體金檢測P r e p a r a t i o n o fA f l a t o x i nB 1A n t i b o d y a n dC o l l o i d a lG o l d T e s t S t r i p黃曲霉毒素B l 抗體的制備及其膠體金檢測試紙條的研制摘 要黃曲霉毒素B l 廣泛存在于糧食作物和飼料中，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強的致癌物質(zhì)之一，其毒性要遠遠高于氰化物、有

2、機農(nóng)藥等，嚴重威脅了人類和動物的生命安全。目前黃曲霉毒素B l 檢測方法大多依靠液相色譜等昂貴的儀器來進行，不利于現(xiàn)場檢測，而且需要專業(yè)的檢測人員來操作儀器，花費時間久且檢測費用高。因此，研究出適合現(xiàn)場檢測且時間短、費用低的檢測方法具有重要的意義。黃曲霉毒素B l 屬于小分子化學物，不能采用直接免疫動物的方法來獲取多克隆抗體?？乖铣墒紫壤敏燃谆u胺半鹽酸鹽進行黃曲霉毒素B 。的改造，使其在碳三位置連接上羧基。2n a gA F B

3、l 于2 m L 吡啶甲醇( V Ⅳ1 ：3 ) 溶液中直接在室溫下進行反應(yīng)，生成肟化物A F B l ．O ，利用薄層層析、紫外掃描和質(zhì)譜進行A F B l ．O 的鑒定，得到其紫外吸收峰為2 0 9 、2 2 0 、2 6 4 、3 6 0 n ／n ，A F B l 的利用率為8 5 ．7 ％。A F B l ．O 在E D C 或者D C C 的作用下與牛血清白蛋白、雞蛋清白蛋白進行偶聯(lián)，得到免疫原A F B l ．O ．B S

4、 A 和包被原A F B l —O ．O V A 。利用免疫原A F B l ．O ．B S A 免疫小鼠，得到多抗血清，利用辛酸．硫酸銨鹽析及透析法進行純化，純化后血清經(jīng)過S D S ．P A G E 電泳顯示為2 條帶。采用間接E L I S A 方法測定血清效價，6 只小鼠的效價均在6 0 0 0 以上，其中3 號小鼠的效價為1 0 0 0 0 以上，抗體濃度為1 ．3 7m g ／m L ，I C —E L I S A 標準曲線

5、為y 一4 3 ．5 0 x + 9 9 ．3 7 ( R Z = 0 ．9 8 8 ) ，I C 5 0 為1 2 ．5 9 n g ／m L 。以檸檬酸鈉還原氯金酸來制備膠體金。以反應(yīng)時間、反應(yīng)p H 、轉(zhuǎn)速進行5 0m L 0 ．0 1 ％氯金酸中加入1 ％檸檬酸鈉2 m L 進行正交實驗，得出最優(yōu)反應(yīng)條件為不加入酸堿物質(zhì)，轉(zhuǎn)速為1 0 0 r ／m i n ，沸騰后反應(yīng)1 0 m i n 條件下制備出來的膠體金良好，電鏡下觀察粒

6、子平均直徑為1 4 。6n l ／1 ，紫外吸收峰為5 1 8 ．5m n 。通過計算得到粒子濃度為6 ．8 ×1 0 1 0 個／c m 3 ，摩爾濃度為1 ．1 3 ×1 0 。o m o l ／L ，每個膠體金粒子中含有9 ．6 4 ×1 0 5 個金原子，其膠體金臨界絮凝濃度為0 ．8g ／m X 。試紙條主要由樣品墊、金標墊、N C 膜和吸水紙等組成。利用目測法和光電比色法確定了最適抗體標記量和最

7、適p H ，穩(wěn)定1m L 膠體金最適抗體穩(wěn)定量為5 5 ．2 嵋，lm L 膠體金中加入1 2 此濃度為0 ．1m o l ／L 碳酸鉀時為最適p H 。制備好的金標探針進行可見光掃描，其吸收峰為5 2 8 ．5n l T l 。采用浸金法制備金標墊，檢測線劃上濃度為1m g ／m L A F B ，．O ．O V A ，質(zhì)控線劃上濃度為1 ．2m g ／m L 羊抗鼠二抗。組裝試紙條后經(jīng)過測定，得到組裝后的試紙條的靈敏度為1 5 0