1、一、研究背景和目的:
　　 在資源昆蟲中，家蠅（Musca domestica）的研究和開發(fā)利用一直受到國內(nèi)外研究者的重視。家蠅幼蟲（蛆）除含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、多糖、礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)外，還含有甲殼素、抗菌肽、凝集素、溶菌酶等生物活性物質(zhì)，在生物醫(yī)藥、食品和飼料開發(fā)等方面有著廣泛的應用價值。在畜禽和水產(chǎn)動物養(yǎng)殖研究中，因家蠅幼蟲的蛋白質(zhì)含量較高，一般認為它是魚粉的優(yōu)質(zhì)替代物，可作為飼料蛋白質(zhì)源組分。也有研究認為，蠅蛆所含有的優(yōu)

2、質(zhì)脂肪、礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)和抗菌肽、凝集素等生物活性物質(zhì)具有促進動物生長，增強動物免疫力的作用。
　　 相對于其它幾種活性成分，甲殼素在家蠅幼蟲蛆殼中的含量較高，可達20％-30％。蠅蛆中的甲殼素以蛋白聚糖的形式存在，并伴生著碳酸鈣，直接添加于飼料中難以被消化，沒有營養(yǎng)作用，有研究認為蠅蛆中的甲殼素可機械性地阻礙腸道吸收蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，是一種抗營養(yǎng)因子，影響動物的消化和吸收功能。作為一種新型的飼料酶制劑，甲殼素酶可降解甲殼素為水

3、溶性寡糖，消除其抗營養(yǎng)因子作用，甲殼素寡糖的生物活性與甲殼素類似或更高，既可作為一種免疫增強劑也可作為一種營養(yǎng)性多糖利用。因此，可以把甲殼素酶作為一種消除抗營養(yǎng)因子的飼料酶制劑添加于含蠅蛆組分的飼料中，降解其中的不溶性甲殼素以提高動物對其它營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用。
　　 目前，通過基因重組技術(shù)將特定酶基因轉(zhuǎn)移到適宜宿主菌內(nèi)發(fā)酵已成為生產(chǎn)飼料酶的有效途徑。作為一種新的蛋白質(zhì)表達技術(shù)，酵母表面展示系統(tǒng)可以把各種生物活性酶表達并固定于細

4、胞表面，產(chǎn)生具有活性的酵母全細胞酶，而利用全細胞酶作為飼料添加劑可避免胞外表達飼料酶制劑生產(chǎn)過程中的純化和載體吸附等繁瑣的下游程序。因此，為了消除家蠅幼蟲中甲殼素的抗營養(yǎng)因子作用，充分發(fā)揮其生物活性，本課題利用公認安全的釀酒酵母作為表達宿主，在其表面展示一種耐熱甲殼素酶，制備出具甲殼素降解活性的全細胞酶，通過鯽魚養(yǎng)殖試驗評價其作為飼料酶添加劑降解蠅蛆中甲殼素后對鯽魚生長性能和非特異性免疫能力的影響，以期研制出一種具有消除甲殼素抗營養(yǎng)因子

5、作用并可促進動物生長、增強動物免疫力的飼料酶制劑，同時進一步提高家蠅蛆粉作為飼料添加劑的利用價值。
　　 論文包括五個部分:
　　 (1)序言（研究背景、目的和思路）
　　 (2)蠅蛆常規(guī)營養(yǎng)成分分析及所含甲殼素的提取與制備
　　 (3)蠅蛆粉對鯽魚的生長性能和非特異性免疫能力的影響
　　 (4)利用酵母表面展示技術(shù)研制一種具甲殼素降解活性的熱穩(wěn)定的全細胞酶
　　 (5)酵母酶作用于家蠅蛆

6、粉后對鯽魚的生長性能和非特異性免疫能力的影響
　　 二、研究方法:
　　 在對家蠅蛆粉的主要營養(yǎng)成分（水分、蛋白質(zhì)和脂肪）含量進行測定的基礎上，用蠅蛆粉按不同比例取代魚粉對鯽魚進行12周飼養(yǎng)試驗，觀察蠅蛆粉對鯽魚生長性能和非特異性免疫能力的影響。在綜合分析上述實驗結(jié)果的基礎上，針對蠅蛆粉中具有的甲殼素可能作為一種影響動物攝食和消化的抗營養(yǎng)因子的情況，研制一種表面展示甲殼素酶的全細胞酵母酶作為降解抗營養(yǎng)因子的飼料酶制劑，并

7、按不同比例添加于含有蠅蛆粉的飼料中，對鯽魚進行12周飼養(yǎng)試驗，觀察添加酵母酶作用于蠅蛆粉中的甲殼素后對鯽魚生長性能和非特異性免疫能力的影響。
　　 具體研究方法如下:
　　 1.采用直接干燥法、分光光度法和酸水解法分別測定魚粉和蠅蛆粉的水分、蛋白質(zhì)和脂肪含量;采用酸堿法和微波加熱法提取蠅蛆殼中的甲殼素。
　　 2.按照試驗要求選擇96尾魚苗，隨機分為4組，每組24尾，每組3個重復，每個重復8尾，其中，第1組為對照

8、組，投喂基礎飼料;其它3組為試驗組，分別投喂含蠅蛆粉為5％、10％和15％的試驗飼料，進行12周養(yǎng)殖試驗，觀察蠅蛆粉對鯽魚生長性能和非特異性免疫能力的影響:
　　 (1)通過魚體的初始、終末體重和飼料消耗量計算各生長指標（體重增加、相對增重率、特異生長率和飼料系數(shù)），統(tǒng)計成活率。
　　 (2)采用稀釋法計數(shù)鯽魚單位容積內(nèi)的紅細胞和白細胞數(shù)，采用Wright-Giemsa復合染色法進行白細胞分類計數(shù)。
　　 (3)

9、應用硝基四氮唑藍還原法檢測血液中嗜中性粒細胞的殺菌功能;以酵母多糖刺激法和硝基四氮唑藍還原法檢測白細胞的呼吸爆發(fā)活性。
　　 (4)分別采用比濁法、黃嘌呤氧化酶法和鐵還原能力測定法測定血清和肝胰臟中的溶菌酶活性、超氧化物歧化酶活性和總抗氧化能力。
　　 (5)分別采用碘-淀粉比色法、精氨酸乙酯法檢測腸和肝胰臟中的淀粉酶和胰蛋白酶活性。
　　 (6)測定鯽魚的含肉率;采用直接干燥法、分光光度法和酸水解法分別測定鯽魚

10、肌肉的水分、蛋白質(zhì)和脂肪含量。
　　 3.利用酵母表面展示技術(shù)研制一種熱穩(wěn)定的具甲殼素降解活性的全細胞酶
　　 (1)根據(jù)GenBank公布的粘質(zhì)沙雷氏菌甲殼素酶C基因(Serratia marcescensChiC)編碼序列設計引物，從粘質(zhì)沙雷氏菌基因組DNA中克隆出ChiC基因，經(jīng)測序鑒定和生物信息學分析后構(gòu)建表面展示載體pYD1-SMChiC，利用a-凝集素受體系統(tǒng)把SMChiC錨定于酵母細胞的細胞壁，構(gòu)建具有甲殼

11、素降解功能的酵母細胞，并采用Western blot對純化的表達產(chǎn)物進行鑒定，采用細胞免疫熒光染色檢測目的蛋白在細胞表面的錨定情況。
　　 (2)優(yōu)化釀酒酵母表面展示SMChiC的表達條件，采用SDS-PAGE酶譜法鑒定純化酶的甲殼素降解活性，采用瓊脂平板培養(yǎng)法和二硝基水楊酸比色法對酵母細胞的甲殼素降解活性進行定性和定量測定。
　　 (3)測試溫度和pH對酵母細胞或純化產(chǎn)物的甲殼素降解活性的影響。
　　 4.按照

12、試驗要求選擇96尾魚苗，隨機分為4組，每組24尾，每組3個重復，每個重復8尾，其中，第1組為對照組，投喂基礎飼料;其他3組為試驗組，分別投喂含酵母酶為0.5％、1.0％和1.5％的試驗飼料，進行12周養(yǎng)殖試驗，觀察酵母酶作用于蠅蛆粉中的甲殼素后對鯽魚生長性能和非特異性免疫能力的影響:
　　 (1)通過魚體的初始、終末體重和飼料消耗量計算各生長指標（體重增加、相對增重率、特異生長率和飼料系數(shù)），統(tǒng)計成活率。
　　 (2)采

13、用稀釋法計數(shù)鯽魚單位容積內(nèi)的紅細胞和白細胞數(shù)，采用Wright-Giemsa復合染色法進行白細胞分類計數(shù)。
　　 (3)應用硝基四氮唑藍還原法檢測血液中嗜中性粒細胞的殺菌功能;以酵母多糖刺激法和硝基四氮唑藍還原法檢測白細胞的呼吸爆發(fā)活性。
　　 (4)分別采用比濁法、黃嘌呤氧化酶法和鐵還原能力測定法測定血清和肝胰臟中的溶菌酶活性、超氧化物歧化酶活性和總抗氧化能力。
　　 (5)分別采用碘-淀粉比色法、精氨酸乙酯法

14、檢測腸和肝胰臟中的淀粉酶和胰蛋白酶活性。
　　 (6)測定鯽魚的含肉率;采用直接干燥法、分光光度法和酸水解法分別測定鯽魚肌肉的水分、粗蛋白質(zhì)和粗脂肪含量。
　　 (7)采集鯽魚肝胰臟、脾臟、腎臟、腸樣本制片并進行蘇木素-伊紅染色，觀察酵母酶對鯽魚組織結(jié)構(gòu)的影響。
　　 4.實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)與標準差((x)±sd)表示，應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析處理實驗數(shù)據(jù)。其中，蠅蛆粉和魚粉的蛋白質(zhì)含量采用獨立樣本T檢驗，

15、P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義(n=3)。鯽魚的生長指標、各類血細胞比例或含量、NBT還原能力和呼吸爆發(fā)活性、相關(guān)酶的活性和總抗氧化能力、肌肉含肉率及主要營養(yǎng)物質(zhì)含量等指標(n=3)的組間比較采用單因素方差分析(One-WayANOVA)，滿足方差齊性和方差分析顯著的情況下，采用Bonferroni法進行組間差異的多重比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 三、研究結(jié)果:
　　 1.對家蠅蛆粉和魚粉的常規(guī)營養(yǎng)成分測

16、定結(jié)果:蛋白質(zhì)含量分別為61.51±1.08％和60.32±1.10％，蠅蛆粉和魚粉之間的差異無統(tǒng)計學意義（t=1.337，P=0.252）。水分分別為6.95±0.11％和8.74±0.13％;脂肪含量分別為13.71±0.13％和7.32±0.11％。以蠅蛆殼提取的甲殼素占干殼重的27.62±0.26％。
　　 2.用蠅蛆粉按不同比例取代魚粉對鯽魚進行12周喂養(yǎng)試驗，結(jié)果顯示:
　　 (1)鯽魚的體重增加（F=7.7

17、35，P=0.009）、相對增重率（F=7.143，P=0.012）、特定生長率（F=7.141，P=0.012）和飼料系數(shù)（F=7.208，P=0.012）在四組間的差異均具有統(tǒng)計學意義，10％蠅蛆粉組的上述各指標效果與對照組之間的差異具有統(tǒng)計學意義（對應的P值分別為0.009、0.012、0.012和0.012）;5％蠅蛆粉組（對應的P值分別為0.261、0.349、0.353和0.184）和15％蠅蛆粉組（對應的P值分別為0.06

18、9、0.099、0.094和0.063）和對照組之間的差異無統(tǒng)計學意義。
　　 (2)鯽魚的白細胞呼吸爆發(fā)活性（F=53.138，P＜0.001）、嗜中性粒細胞的吞噬功能(F=17.817，P=0.001)、血清SOD酶活性(F=10.593，P=0.004)、肝胰臟SOD酶活性(F=4.972，P=0.031)、血清總抗氧化能力（F=9.042，P=0.006）、肝胰臟總抗氧化能力（F=9.343，P=0.005）在四組間的差

19、異均具有統(tǒng)計學意義。其中，以10％蠅蛆粉組的上述各種指標均顯著高于對照組（P值分別為0.001、0.001、0.004、0.046、0.015和0.006）;鯽魚血清中溶菌酶活性有增強的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（F=0.118，P=0.947）。
　　 (3)中性粒細胞分數(shù)（F=0.612，P=0.626）、嗜堿性粒細胞分數(shù)（F=0.225，P=0.876）、淋巴細胞分數(shù)（F=0.387，P=0.766）、單核細胞分數(shù)（F=0.

20、409，P=0.751）、紅細胞含量(F=0.354，P=0.788)和白細胞含量(F=0.248，P=0.861)在四組間的差異無統(tǒng)計學意義。
　　 (4)腸組織淀粉酶活性（F=0.273，P=0.844）、肝胰臟淀粉酶活性（F=1.698，P=0.244）、腸組織胰蛋白酶活性（F=1.815，P=0.222）和肝胰臟胰蛋白酶活性(F=3.301，P=0.079)在四組間的差異無統(tǒng)計學意義。
　　 (5)鯽魚含肉率（F

21、=3.272，P=0.080）、肌肉的水分（F=0.284，P=0.836）、蛋白質(zhì)含量（干重％）（F=1.714，P=0.241）和脂肪含量（干重％）（F=0.026，P=0.994）在四組間的差異無統(tǒng)計學意義。
　　 3.從Serratia marcescens AS1.1652菌株基因組中擴增得到了ChiC基因編碼序列，測序結(jié)果分析表明，AS1.1652 ChiC基因含有1443bp，推導的Serratia marcesc

22、ensAS1.1652 chitinase C含有480個氨基酸，預測該蛋白的等電點為5.36，分子量約為52kD，且該蛋白不含信號肽。Serratia marcescens AS1.1652 chitinase C和其他菌株（stain2170，strain141，strain xd1，stain BJL200）在DNA水平上的相似性分別為96％、96％、96％、98％;在蛋白質(zhì)水平上的相似性分別為99％、98％、98％、99％。構(gòu)建

23、的酵母表面展示質(zhì)粒pYD1-SMChiC中，ChiC基因通過(Gly4-Ser)3 Linker編碼序列融合于Aga2 gene的C端，C端V5表位或6×His標簽可用于融合蛋白質(zhì)的檢測。
　　 4.經(jīng)免疫熒光染色鑒定，證實甲殼素酶已經(jīng)表達并固定于釀酒酵母細胞表面。表達產(chǎn)物（Aga2-SMChiC融合蛋白）經(jīng)Western Blot鑒定，大小約67kD;應用瓊脂平板法和SDS-PAGE酶譜法檢測證實甲殼素酶在酵母中成功表達，且對

24、α-型和β-型甲殼素均具降解活性。對甲殼素酶的表達和展示條件進行了優(yōu)化，其最佳誘導時間、溫度和pH分別為72h、22℃和6.0。
　　 5.酵母酶在20℃-80℃之間均具有甲殼素降解活性，在80℃仍然能夠檢測到初始活性的9％，其最適反應溫度為52℃。熱穩(wěn)定性測試表明，70℃處理4h后酵母酶保留其初始活性的88.6％，把酶煮沸1h后其活性仍然保留一定活性，純化酶的酶譜檢測結(jié)果也證實在一定高溫下酶具有熱穩(wěn)定性。酵母酶在pH2.2-8

25、.0條件下均可顯示活性，最適pH為5.0，在酸性條件下，全細胞酵母酶保持一定的穩(wěn)定性。
　　 6.以不同比例的酵母酶添加于含10％蠅蛆粉的飼料中，對鯽魚進行12周喂養(yǎng)試驗，結(jié)果顯示:
　　 (1)鯽魚的體重增加(F=37.289，P＜0.001)、相對增重率(F=33.053，P＜0.001)、特定生長率（F=31.435，P＜0.001）和飼料系數(shù)(F=47.163，P＜0.001)在四組間的差異均具有統(tǒng)計學意義。0.

26、5％酵母酶組(P值分別為0.004、0.006、0.008、0.001)、1.0％酵母酶組（P值分別為0.001、＜0.001、＜0.001、＜0.001）、1.5％酵母酶組（P值分別為0.001、0.003、0.003、＜0.001）的體重增加、相對增重率和特定生長率均顯著高于對照組，而飼料系數(shù)均顯著低于對照組。
　　 (2)鯽魚的嗜中性粒細胞吞噬功能（F=36.935，P＜0.001）和白細胞呼吸爆發(fā)活性（F=96.737，

27、P＜0.001）在四組間的差異均具有統(tǒng)計學意義。0.5％酵母酶組（P值分別為0.014、＜0.001）、1.0％酵母酶組（P值分別為＜0.001、＜0.001）、1.5％酵母酶組（P值分別為0.037、＜0.001）的上述指標均顯著高于對照組。
　　 (3)鯽魚血清中的溶菌酶活力（F=34.057，P＜0.001）、SOD酶活力(F=33.490，P＜0.001)、總抗氧化能力（F=20.579，P＜0.001）和肝胰臟中的溶菌

28、酶活力（F=35.497，P＜0.001）、SOD酶活力（F=16.673，P=0.001）、總抗氧化能力(F=24.374，P＜0.001)在四組間的差異均具有統(tǒng)計學意義。其中，0.5％酵母酶組（P值分別為0.001、0.001、0.002、＜0.001）、1.0％酵母酶組（P值分別為0.001、P＜0.001、0.001、＜0.001）、1.5％酵母酶組(P值分別為0.001、0.001、0.001、＜0.001)的血清溶菌酶活性、

29、SOD酶活性、總抗氧化能力和肝胰臟溶菌酶活性均顯著高于對照組。1.0％酵母酶組的肝胰臟SOD酶活性顯著高于對照組(P=0.001)。1.0％酵母酶組(P＜0.001)和1.5％酵母酶組(P=0.004)肝胰臟勻漿中的總抗氧化能力顯著高于對照組。
　　 (4)中性粒細胞分數(shù)（F=1.590，P=0.266）、嗜堿性粒細胞分數(shù)（F=0.277，P=0.875）、淋巴細胞分數(shù)（F=0.877，P=0.492）、單核細胞分數(shù)（F=1.9

30、23，P=0.204）、紅細胞含量(F=0.344，P=0.795)和白細胞含量（F=0.061，P=0.979）在四組間的差異無統(tǒng)計學意義。
　　 (5)腸組織淀粉酶活性（F=0.240，P=0.866）、肝胰臟淀粉酶活性（F=1.285，P=0.344）、腸組織胰蛋白酶活性（F=1.110，P=0.400）和肝胰臟胰蛋白酶活性（F=2.043，P=0.187）在四組間的差異無統(tǒng)計學意義。
　　 (6)鯽魚含肉率（F=

31、0.478，P=0.706）、肌肉的水分（F=1.706，P=0.243）、蛋白質(zhì)含量（干重％）（F=0.016，P=0.997）和脂肪含量（干重％）（F=0.076，P=0.971）在四組間的差異無統(tǒng)計學意義。
　　 (7)病理切片鏡檢結(jié)果表明各酵母酶組飼養(yǎng)鯽魚主要臟器器官未見異常改變，實驗過程中未對鯽魚臟器造成不良影響。
　　 四、結(jié)論:
　　 蠅蛆粉和魚粉的蛋白質(zhì)含量相近，但蠅蛆殼中含有的甲殼素不溶于水，可

32、能具有抗營養(yǎng)因子作用。蠅蛆粉部分取代魚粉能促進鯽魚生長，提高飼料利用效率，增強鯽魚白細胞吞噬功能和呼吸爆發(fā)能力，并可增強魚體抗氧化能力，從而增強其非特異性免疫功能，且對魚肉品質(zhì)無不良影響。結(jié)果表明蠅蛆粉可以部分取代魚粉作為優(yōu)質(zhì)的飼料蛋白質(zhì)源。
　　 表面展示SerratiamarcescensChiC的釀酒酵母全細胞具有甲殼素降解活性，是一種具有熱穩(wěn)定性的耐高溫酶，且在較低pH條件仍保持一定的穩(wěn)定性。具有甲殼素降解活性的酵母酶可