1、黑線倉鼠(Cricetulus barabensis)是一種典型的季節(jié)性繁殖動物,也是華北地區(qū)農(nóng)業(yè)害鼠的優(yōu)勢種,高繁殖力是影響其種群數(shù)量波動的主要原因之一,因此研究黑線倉鼠的季節(jié)性繁殖調(diào)控機制顯得尤為重要。本文從繁殖調(diào)控相關(guān)基因KiSS-1和GPR54入手,從分子水平上揭示害鼠種群數(shù)量季節(jié)性波動機制,對鼠害的綜合防控提供新的思路。KiSS-1是與動物繁殖行為密切相關(guān)的基因,其編碼產(chǎn)物Kisspeptins通過與GPR54結(jié)合發(fā)揮調(diào)節(jié)功能

2、,KiSS-1/GPR54系統(tǒng)不僅介導(dǎo)了光周期對繁殖的調(diào)節(jié),還影響著動物的青春期啟動、發(fā)情周期維持以及探究、攻擊、擇偶等多種行為。本研究通過RT-PCR的方法克隆黑線倉鼠的KiSS-1和GPR54 cDNA序列,并使用生物信息學的分析方法預(yù)測蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)及功能,結(jié)合多個物種的相應(yīng)序列進行分子系統(tǒng)進化研究,采用實時熒光定量的方法分別檢測兩者在不同發(fā)育階段、不同發(fā)情周期和不同組織器官中的表達情況,預(yù)測KiSS-1/GPR54在黑線倉鼠生

3、長、發(fā)育以及繁殖過程中所起的作用,從分子生物學角度尋找控制黑線倉鼠數(shù)量及其危害的有效方法。
　　本研究克隆拼接獲得完整的KiSS-1和部分GPR54的cDNA序列。其中,KiSS-1 cDNA序列558bp,包含完整的CDS區(qū)和3￠端,GenBank登錄號:JQ219667;GPR54 cDNA序列578bp,全為編碼區(qū)序列,GenBank登錄號:JQ685855。采用生物信息學方法對兩基因的核苷酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列進行分析,

4、并預(yù)測其蛋白質(zhì)二級、三級結(jié)構(gòu)。研究結(jié)果表明:KiSS-15￠端編碼的MTALASWQLLLLLCVTIFG19個氨基酸是Kisspeptins的信號肽序列,NWNSFGLRY氨基酸殘基構(gòu)成成熟的Kisspeptin-10分子,67位的-R和121-122位的-RR是可能的水解位點,其蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中含有較多的α螺旋,對Kisspeptins功能的發(fā)揮有重要意義,同時應(yīng)用CPHmodel程序預(yù)測得到了KiSS-1的三級結(jié)構(gòu)。擴增得到的GP

5、R54編碼區(qū)序列涵蓋了完整的7個跨膜α螺旋中的前四個螺旋,包括兩個胞內(nèi)環(huán)和兩個胞外環(huán),在第4外顯子處存在一處可能的可變剪接位點,并用SWISS-MODEL程序預(yù)測得到了該蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)。使用Clustal2.0分別將黑線倉鼠KiSS-1和GPR54 cDNA序列與金倉鼠(Mesocricetus auratus)、大鼠、小鼠、人等多個物種的相應(yīng)cDNA序列進行同源性對比分析,并使用MEGA5.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,聚類分析表明,黑線倉鼠與金

6、倉鼠親緣關(guān)系最近,與大鼠、小鼠較近,與偶蹄目和靈長目的幾個物種親緣關(guān)系均較遠。
　　隨后,本研究分別比較了KiSS-1和GPR54在雌雄黑線倉鼠亞成年期、成年發(fā)情期以及老年期三個發(fā)育時期下丘腦和生殖器官(♀:卵巢、子宮;♂:睪丸、附睪)中的相對表達量。結(jié)果發(fā)現(xiàn):KiSS-1和GPR54在下丘腦和生殖器官中均有表達,但兩基因的表達模式在不同發(fā)育時期和不同器官中表現(xiàn)并不同。KiSS-1和GPR54在雌性亞成體中表達明顯高于其他各發(fā)育時

7、期,發(fā)揮了顯著的作用,這與 KiSS-1/GPR54系統(tǒng)能激發(fā)幼體青春期發(fā)育的研究結(jié)果相一致。KiSS-1和GPR54發(fā)揮生理作用的部位隨發(fā)育時期的不同會發(fā)生遷移,幼年時期主要在中樞器官發(fā)揮功能,成年期之后逐漸向外周器官(以旁分泌方式發(fā)揮作用)轉(zhuǎn)移。這與已有的關(guān)于KiSS-1青春期發(fā)育啟動的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控機制相一致。不同發(fā)情周期中,中樞和外周器官的KiSS-1和GPR54表達量也并不相同。成年雌鼠下丘腦KiSS-1的表達呈現(xiàn)脈沖式周期波

8、動,發(fā)情間期表達較少,在發(fā)情前期達到高峰,發(fā)情期、發(fā)情后期表達略有減少,GPR54僅在發(fā)情前期和發(fā)情期表達顯著增高,因此推測發(fā)情周期的維持方面,KiSS-1和GPR54可能存在不同的調(diào)節(jié)模式,兩者的結(jié)合調(diào)控可能表現(xiàn)出與KiSS-1表達相一致的“劑量依賴”關(guān)系,且卵巢等處KiSS-1表達峰滯后于下丘腦的KiSS-1表達峰,推測這可能是與調(diào)控的精確性和時序性相適應(yīng)的結(jié)果。
　　實驗通過模擬自然光照的變化,研究了不同光周期影響下雌雄黑線

9、倉鼠在生理、生態(tài)、分子遺傳學的變化。結(jié)果說明,長光周期及漸長光周期對黑線倉鼠的繁殖有促進作用,短光周期和漸短光周期對黑線倉鼠體重、靜止代謝、自發(fā)行為、攻擊行為等方面的抑制作用較為顯著。激素檢測結(jié)果顯示,雌性黑線倉鼠褪黑激素的含量與下丘腦 KiSS-1的mRNA表達量呈顯著負相關(guān),血清和糞便樣品中的雌激素含量與卵巢KiSS-1的mRNA表達量呈正相關(guān)。雌性黑線倉鼠KiSS-1的調(diào)控途徑在不同漸變光周期下可能存在不同,漸長光周期下主要集中在

10、中樞神經(jīng)處,而漸短光周期和對照光周期時,由于中樞神經(jīng)的褪黑激素抑制作用加強,KiSS-1的調(diào)控作用逐漸向外周調(diào)控途徑轉(zhuǎn)變。在這兩種器官中,GPR54表達變化均與卵巢中KiSS-1的表達方式相近。綜上所述,研究KiSS-1/GPR54對動物繁殖行為的調(diào)節(jié)不能孤立地研究KiSS-1和GPR54的分子結(jié)構(gòu)及其表達量的變化,應(yīng)結(jié)合與其馴化條件、生理時期綜合考慮。
　　本研究通過實驗室模擬光周期變化與分子生物學研究方法相結(jié)合,從分子的角度初