1、番茄斑萎病毒（Tomatospottedwiltvirus，TSWV）是布尼亞病毒科(Bunyaviridae)番茄斑萎病毒屬（Tospovirus）的代表成員，該病毒的寄主范圍廣泛，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)危害嚴(yán)重。已經(jīng)被列為世界危害最大的十種植物病毒之一。TSWV目前尚無(wú)有效的防治措施，研究該病毒快速高效的檢測(cè)方法，有助于早期發(fā)現(xiàn)病毒并及時(shí)采取措施進(jìn)行防治，從而減輕該病毒所造成的經(jīng)濟(jì)損失。本實(shí)驗(yàn)利用SYBRGreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，建立

2、了TSWV的快速定量定性檢測(cè)方法。
　　根據(jù)TSWV外殼蛋白N基因序列，設(shè)計(jì)了實(shí)時(shí)熒光定量PCR的特異性引物，獲得了140bp大小的片段，并將小片段克隆到PEASYTM-T5載體上，經(jīng)過(guò)菌落PCR篩選、酶切、測(cè)序等結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增獲得片段與N基因部分片段同源性高，表明設(shè)計(jì)的引物特異性好;且該片段已經(jīng)成功連接至載體，得到了重組質(zhì)粒。
　　以得到的重組質(zhì)粒作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行一系列的梯度稀釋，選擇6個(gè)

3、梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行SYBRGreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=-3.538x+37.233，該擴(kuò)增反應(yīng)的效率為91.7％，相關(guān)系數(shù)為0.978，檢測(cè)范圍為9.84×101copies/μL～9.84×106copies/μL。熔解曲線只出現(xiàn)特異性的單個(gè)峰，而沒(méi)有明顯的引物二聚體或者非特異性擴(kuò)增的峰出現(xiàn)，證明該方法具有良好的特異性。組間和組內(nèi)的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果CV值均小于3％，表明該方法具有良好的重復(fù)性