1、目的：
　　 通過研究應(yīng)用生物絮團技術(shù)的羅氏沼蝦育苗水體各項指標:氨氮、亞硝酸鹽、溶解氧、葡萄糖殘留、生化需氧量和生物絮團含量的變化及水體中的微生物多樣性的變化，闡明不同的葡萄糖添加濃度時生物絮團對羅氏沼蝦育苗水質(zhì)的影響，初步確定較好的葡萄糖使用濃度，為發(fā)展更經(jīng)濟環(huán)保的育苗方法提供基礎(chǔ)資料和科學依據(jù)。同時，利用羅氏沼蝦雙順反子病毒外膜蛋白編碼基因VP3，進行原核表達和動物免疫，獲得多克隆抗體，初步建立ELISA檢測方法，為建立該

2、病毒的快速簡便檢測方法及雙順反子病毒的深入研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.在浙江南太湖淡水水產(chǎn)種業(yè)有限公司進行為期27天的育苗實驗，期間對水體的各項指標進行不間斷檢測，及時保存后續(xù)實驗所需的生物絮團及蝦苗樣品。
　　 2.根據(jù)實驗室自行設(shè)計的引物對保存的幼體進行羅氏沼蝦雙順反子病毒PCR檢測。利用變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析微生物多樣性變化，確定生物絮團技術(shù)對水體中微生物多樣性的影響。
　　

3、3.根據(jù)羅氏沼蝦雙順反子病毒的全基因序列，選取病毒外膜蛋白VP3的編碼基因，設(shè)計引物，序列如下:上游F:CGGAATTCATGXAGAGCAATATGCTTCTCTT，下游R: ACGCGTCGACTTACCTGGATGGCCCATAAGT。構(gòu)建克隆載體及表達載體，獲得可穩(wěn)定表達蛋白的重組細菌，獲得表達蛋白，進行動物免疫獲得高效價多克隆抗體血清。
　　 4.通過不同組ELISA實驗摸索并確定最適抗原包被濃度、包被條件、封閉時間、

4、孵育時間、酶標二抗作用時間、顯色時間和靈敏度等，初步建立羅氏沼蝦雙順反子病毒的ELISA快速檢測方法。
　　 結(jié)果：
　　 1.各組生物絮團含量無顯著差異。葡萄糖終濃度為20 mg/L組的氨態(tài)氮和亞硝酸氮顯著低于對照組(T-test，P＜0.05)，溶解氧和化學需氧量(COD)在試驗組與對照組之間不存在顯著差異。生物絮團技術(shù)應(yīng)用于羅氏沼蝦育苗中，對水體中溶氧含量無明顯影響，但對氨氮鹽和亞硝酸氮鹽含量有較高的去除能力。出苗

5、率及生長測定表明，對照組出苗率為32.60％，20 mg/L試驗組為60.60％，比對照組高了85.90％。對照組仔蝦體長平均值為8.193 mm，20 mg/L試驗組體長平均值為10.488 mm，比對照組高了28.00％。
　　 2.2.DGGE結(jié)果顯示，所有組中均檢測出鹽螺旋藻屬細菌。除此之外，相較于對照組，試驗組中檢測出芽孢桿菌屬細菌，該屬細菌大部分在水產(chǎn)上隸屬于有益菌。相反對照組檢測出氣單胞菌屬細菌和假單胞菌屬細菌，且

6、氣單胞菌屬細菌為優(yōu)勢菌群之一。試驗組中檢測出氣單胞菌屬細菌，但并不是優(yōu)勢菌群。
　　 3.通過PCR擴增，蛋白重組表達，抗體制備獲得羅氏沼蝦雙順反子病毒外膜蛋白VP3多克隆抗血清，間接ELISA和Westen-blotting實驗結(jié)果顯示獲得的多克隆抗血清可特異性與重組表達蛋白及提純病毒間發(fā)生反應(yīng)，且特異性較高。
　　 4.ELISA實驗結(jié)果顯示，最適抗原包被濃度為1∶100;最適血清使用濃度為1∶8000;最佳包被條件

7、為37℃2h后4℃過夜;最佳封閉條件為37℃1 h;最佳血清孵育時間為37℃1 h;最佳酶標二抗作用時間45 min;最佳顯色時間15 min。應(yīng)用該方法，可以檢出實驗室自備的陽性病毒樣品，靈敏度為1∶103。
　　 結(jié)論：
　　 1.生物絮團技術(shù)的應(yīng)用可以較好的控制水體中亞硝酸鹽和氨氮的含量，但對溶解氧及COD的影響不大。生物絮團技術(shù)也可以促進幼體生長和提高幼體成活率。
　　 2.生物絮團技術(shù)可以改變水體中微生