1、口蹄疫(foot-and-mouthdisease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(FMDvirus，F(xiàn)MDV)感染偶蹄類動(dòng)物所引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，目前還沒有安全有效的防控措施。實(shí)驗(yàn)證明，F(xiàn)MDV野毒株并不感染樹突狀細(xì)胞（Dendriticcells，DCs），但被中和抗體IgG調(diào)理的FMDV不僅可以感染DCs，導(dǎo)致其抗原提呈功能喪失，而且還造成DCs大量死亡。當(dāng)DCs負(fù)載滅活FMDV免疫復(fù)合物后卻能夠有效地刺激T細(xì)胞，并產(chǎn)

2、生很好的免疫保護(hù)。因此，人們開始重視機(jī)體對(duì)FMDV細(xì)胞免疫應(yīng)答機(jī)制的研究。而啟動(dòng)細(xì)胞免疫應(yīng)答需要DCs的抗原提呈，但目前尚未見此類研究報(bào)道。
　　 本研究通過構(gòu)建pET32a-VP1-VP4原核表達(dá)體系，表達(dá)重組VP1-VP4結(jié)構(gòu)蛋白，并進(jìn)行FITC標(biāo)記。通過將甘露糖受體(mannosereceptor,MR)抑制劑、清道夫受體（scavengerreceptor,SR）抑制劑、巨吞飲抑制劑、Hsp90抑制劑、蛋白酶體抑制劑、溶

3、酶體酸化和溶酶體酶抑制劑、循環(huán)內(nèi)體轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑以不同組合處理骨髓源樹突狀細(xì)胞(BMDCs)，再用VP1-VP4負(fù)載BMDCs。利用激光共聚焦熒光顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)和ELISA等方法檢測(cè)BMDCs對(duì)VP1-VP4攝取、加工與呈遞的動(dòng)力學(xué)過程。
　　 激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在正常組BMDCs，被攝取的VP1-VP4-FITC抗原位于早期內(nèi)吞小體，并且細(xì)胞內(nèi)抗原的量隨著攝取時(shí)間增加而增加，形成的內(nèi)吞小體逐漸增大。抑制巨吞飲后的BMD

4、Cs內(nèi)含VP1-VP4的內(nèi)吞小體顯著減少，說明巨吞飲是BMDCs攝取VP1-VP4的主要方式。而經(jīng)MR抑制劑或SR抑制劑處理的BMDCs在不同時(shí)間出現(xiàn)VP1-VP4抗原攝取量增加的變化，表明MR與SR對(duì)VP1-VP4的識(shí)別可抑制BMDCs的抗原攝取功能。在經(jīng)溶酶體酶抑制劑處理的BMDCs，可見VP1-VP4-FITC抗原在溶酶體內(nèi)的積累，說明溶酶體在抗原的降解過程中發(fā)揮重要作用。分別抑制Hsp90或蛋白酶體之后，VP1-VP4抗原在BM

5、DCs內(nèi)的聚集均顯著增加。當(dāng)同時(shí)抑制Hsp90與蛋白酶體后，這種聚集的增加更加顯著，甚至形成單一的形態(tài)巨大的抗原聚集小泡。這提示Hsp90在將內(nèi)吞小體中的VP1-VP4轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮重要作用。
　　 用VP1-VP4負(fù)載BMDCs，并與淋巴結(jié)T細(xì)胞共培養(yǎng)，然后用流式細(xì)胞儀對(duì)BMDCs進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示BMDCs表面MHCⅡ表達(dá)量升高，CD11c的表達(dá)量略有減少，表明VP1-VP4可以活化BMDCs。抑制溶酶體酶的活性之后，M

6、HCⅡ表達(dá)量變化較小，但是CD11c表達(dá)水平降低。抑制循環(huán)內(nèi)體的轉(zhuǎn)運(yùn)功能之后，MHCⅡ的表達(dá)顯著升高，幾乎呈全陽性表達(dá)，在同時(shí)抑制循環(huán)內(nèi)體與溶酶體的BMDCs，MHCⅡ表達(dá)量更高，同時(shí)CD11c的表達(dá)也明顯升高，但不同處理組BMDCs的CD80表達(dá)水平都非常低，這提示BMDCs還可能存在其他降解VP1-VP4抗原的機(jī)制。
　　 用ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，負(fù)載VP1-VP4抗原的BMDCs與T細(xì)胞共培養(yǎng)的上清液中含有大量的IFN-γ和

7、IL-17，而IL-4和TGF-β1的含量極低。無論抑制Hsp90、蛋白酶體，還是溶酶體，都會(huì)引起IFN-γ水平極顯著降低(P＜0.01)，證明Hsp90、蛋白酶體和溶酶體在FMDVVP1-VP4抗原加工過程中發(fā)揮非常重要的作用。值得注意的是，小劑量Hsp90抑制劑組(200nmol/mL)產(chǎn)生IFN-γ的量高于大劑量組(1μmol/mL)，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有極顯著差異(P＜0.01)，并且Hsp90抑制劑與蛋白酶體抑制劑同時(shí)使用后表現(xiàn)相

8、同的趨勢(shì)。但是大劑量Hsp90抑制劑（1μmol/mL）與蛋白酶體抑制劑同時(shí)使用組產(chǎn)生IFN-γ的量高于單獨(dú)使用Hsp90抑制劑組，而小劑量Hsp90抑制劑(200nmol/mL)與蛋白酶體抑制劑同時(shí)使用組產(chǎn)生IFN-γ的量低于單獨(dú)使用Hsp90抑制劑組。推測(cè)當(dāng)Hsp90被高度抑制之后，保存完好的抗原表位可以通過溶酶體途徑進(jìn)行提呈，產(chǎn)生較高水平的IFN-γ。Primaquine能阻斷內(nèi)吞小體重返細(xì)胞膜的過程。在抑制蛋白酶體的前提下，用大

9、劑量Primaquine(100nmol/mL)處理的BMDCs刺激T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于小劑量組(50nmol/mL)，這表明交叉提呈途徑在BMDCs提呈VP1-VP4抗原的過程中起著非常重要的作用。
　　 通過對(duì)IL-17的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，IL-17的含量都非常高（含Chloroquine的處理組除外），并且迅速達(dá)到釋放量的峰值（48h之內(nèi)），72和96h各處理組所產(chǎn)生IL-17的量沒有顯著差異（P＞0.05），并且各處

10、理組IL-17檢測(cè)水平與本組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)上IFN-γ的釋放趨勢(shì)保持一致。值得注意的是，IFN-γ的濃度在96h內(nèi)呈現(xiàn)持續(xù)升高的變化趨勢(shì)，而IL-17在48h內(nèi)達(dá)到峰值。
　　 從以上結(jié)果可以得出結(jié)論:BMDCs主要通過巨吞飲的方式攝取VP1-VP4抗原，在細(xì)胞內(nèi)形成包裹VP1-VP4的內(nèi)吞小體，后者與溶酶體融合，VP1-VP4由此被降解，產(chǎn)生的抗原表位與MHCⅡ分子結(jié)合，提呈給CD4+T細(xì)胞。內(nèi)吞小體中的VP1-VP4也可被Hsp