1、<p>　申請(qǐng)代碼：</p><p>　受理部門：</p><p>　收件日期：</p><p>　受理編號(hào)：</p><p><b>　　國(guó)家自然科學(xué)基金</b></p><p><b>　　申 請(qǐng) 書</b></p><p><b&

2、gt;　　資助類別： </b></p><p><b>　　亞類說明： </b></p><p><b>　　附注說明： </b></p><p><b>　　項(xiàng)目名稱： </b></p><p>　　申 請(qǐng) 者： 電話： <

3、;/p><p><b>　　依托單位： </b></p><p><b>　　通訊地址： </b></p><p>　　郵政編碼： 單位電話： </p><p><b>　　電子郵件： </b></p><p>　　申報(bào)日期：

4、 200?年??月??日</p><p>　　國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)</p><p>　　基本信息0UQpCL0k</p><p>　　項(xiàng)目組主要成員(國(guó)家杰出青年科學(xué)基金不填此欄)</p><p>　　說明: 1. 高級(jí)、中級(jí)、初級(jí)、博士后、博士生、碩士生人員數(shù)由申請(qǐng)者負(fù)責(zé)填報(bào)，總?cè)藬?shù)自動(dòng)生成。</p>&

5、lt;p>　　說明: 2. 項(xiàng)目組主要成員不包括項(xiàng)目申請(qǐng)者。</p><p>　　經(jīng)費(fèi)申請(qǐng)表 （金額單位：萬元）</p><p><b>　　報(bào)告正文</b></p><p>　?。ㄒ唬┝㈨?xiàng)依據(jù)與研究?jī)?nèi)容（4000-8000字）： </p

6、><p>　　1.    項(xiàng)目的立項(xiàng)依據(jù)</p><p>　　銀屑病是一種多基因遺傳背景下的免疫異常疾病，因其具有發(fā)病率較高和主要累及青壯年等特點(diǎn)而在皮膚科臨床和科研領(lǐng)域倍受重視。從病理學(xué)上看，角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和分化的異常，角質(zhì)層中性粒細(xì)胞聚集所形成的Munro微膿瘍以及真皮淺層血管周圍以淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)是銀屑病的三個(gè)最主要的特點(diǎn)。盡管三者之間存在非常復(fù)

7、雜的相互作用和因果關(guān)系，但一般認(rèn)為，真皮內(nèi)聚集并活化的T淋巴細(xì)胞是銀屑病皮損發(fā)生的始動(dòng)因素，活化的T細(xì)胞可產(chǎn)生bEGF，INF-γ和IL-8等細(xì)胞/趨化因子，從而導(dǎo)致表皮角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和分化狀態(tài)的異常并誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞表皮內(nèi)趨化和聚集[1]。 </p><p>　　從目前銀屑病的藥物治療手段上看，維A酸類藥物和蒽林的主要作用機(jī)理是調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增殖和分化狀態(tài)；傳統(tǒng)免疫抑制劑 （糖皮質(zhì)激素和MTX等）以及新

8、型免疫抑制劑（環(huán)孢素A，他克莫司，匹美克莫司，西洛莫司等）的主要作用機(jī)理是抑制T細(xì)胞的增殖和活化；細(xì)胞/趨化因子（TNF-α，CD4，CD25，CD11a，IL-2R，IL-6R，IL-12等）抗體主要是阻斷T細(xì)胞活化及其相關(guān)作用；IL-8抗體主要是阻斷中性粒細(xì)胞的趨化。但由于以上藥物治療手段各自不同的副作用和作用靶環(huán)節(jié)的相對(duì)單一性，其治療效果及運(yùn)用前景尚不能完全令人滿意。因此，我們需要尋找同時(shí)參與銀屑病多個(gè)病理生理學(xué)環(huán)節(jié)的新的靶分子及

9、其適當(dāng)?shù)囊种仆緩剑瑥亩鵀殚_辟銀屑病新的研究領(lǐng)域和探尋銀屑病新的治療手段提供理論依據(jù)。</p><p>　　Basigin/CD147分子是一種屬于免疫球蛋白超家族成員的新型跨膜糖蛋白，本研究組成員曾首次克隆該分子并發(fā)現(xiàn)它廣泛存在于不同組織和細(xì)胞中，在細(xì)胞粘附及胚胎發(fā)育等方面發(fā)揮重要作用[2]。本研究群體從1998年開始圍繞CD147在角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖和分化以及皮膚腫瘤中的作用及機(jī)制開展了系列研究，并取得了一些

10、原創(chuàng)性的科研成果：首先是明確了CD147位于角質(zhì)形成細(xì)胞膜微絨毛的超微分布特點(diǎn)，從而提示這一分子可能在細(xì)胞粘附、細(xì)胞內(nèi)外分子協(xié)同作用以及細(xì)胞膜受體等方面發(fā)揮重要作用[3]；然后，我們又利用大量實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)：在皮膚鱗狀細(xì)胞癌及惡性黑色素瘤的腫瘤細(xì)胞膜上CD147的表達(dá)顯著增高，增高表達(dá)的CD147分子可以通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周圍成纖維細(xì)胞表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），從而在多種皮膚腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用[4-7]；另外，我們還率先證實(shí)了

11、CD147與生理和病理狀態(tài)下角質(zhì)形成細(xì)胞分化狀態(tài)密切相關(guān)，是一種新的低分化角質(zhì)形成細(xì)胞的標(biāo)志蛋白，并可能發(fā)揮抑制角質(zhì)形成細(xì)胞分化的作用[3，7-9]，從而在“角質(zhì)形成細(xì)胞分化異?！边@一層面上為開辟銀屑病新的科研領(lǐng)域提供了一個(gè)很有價(jià)值的靶分子。</p><p>　　更為引起我們重視的是，幾乎所有的T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞中均有CD147分子的增高表達(dá)[10]，CD147還被證明與T細(xì)胞的發(fā)育[11]、分化[12]，特別是活

12、化[13]密切相關(guān)。Kasinrerk 等的早期研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)PHA誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞中CD147的表達(dá)顯著增高[13]；進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞膜上的CD147分子可以參與CD3介導(dǎo)的T細(xì)胞活化[14]；CD98是一種與T細(xì)胞等炎癥細(xì)胞活化和聚集密切相關(guān)的分子，而CD147抗體能抑制CD98介導(dǎo)的炎癥細(xì)胞聚集[15]；最近的研究顯示，T細(xì)胞膜上的CD147分子可能是通過受體-配體的信息傳導(dǎo)作用影響T細(xì)胞的增殖與活化[16]。</p&

13、gt;<p>　　親環(huán)素（cyclophilin, CyP）是一種保守的蛋白家族，存在于包括T細(xì)胞在內(nèi)的多種人體細(xì)胞中, CyP家族有CyPA、CyPB、CyPC、CyPD等成員，其分子量以及亞細(xì)胞定位各不相同。該組蛋白有兩個(gè)共同特征，一是具有肽基脯氨酸順/反異構(gòu)酶活性,可催化細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)；二是能與進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的免疫抑制劑（環(huán)孢素A等）結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物可抑制神經(jīng)鈣調(diào)磷酸酶，進(jìn)而抑制T細(xì)胞核活化因子（NFA

14、T），導(dǎo)致活化T細(xì)胞的相關(guān)細(xì)胞因子基因不能轉(zhuǎn)錄和翻譯，阻斷T細(xì)胞信號(hào)傳遞從而實(shí)現(xiàn)環(huán)孢素A的免疫抑制作用。此外, CyP還可被活化的T細(xì)胞分泌,以細(xì)胞因子樣的方式參與多種生理和病理過程。</p><p>　　CyPA是CyP家族的主要成員，由165個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子量18kDa，約占細(xì)胞蛋白總量的0.1％－0.4％，主要位于胞質(zhì)內(nèi)?？捎蒚細(xì)胞等炎癥細(xì)胞分泌，是一種嗜中性粒細(xì)胞[17]、T細(xì)胞[18]和嗜酸性粒細(xì)

15、胞[19]的趨化因子。實(shí)驗(yàn)證實(shí)CyPA的受體與人CD147 cDNA 的核苷酸排列有97％的同源性，作為CyPA的受體，CD147可以在CyPA介導(dǎo)的信號(hào)傳遞中發(fā)揮重要作用[20]。作為艾滋病毒整合CyPA分子的受體，CD147參與了艾滋病毒進(jìn)入和感染宿主細(xì)胞的過程[21]。最新的研究顯示，CyPA可以調(diào)節(jié)細(xì)胞膜上CD147的表達(dá)水平[22,23]。CyPB是CyP家族的另一主要成員，主要存在于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，并可分泌到細(xì)胞外在細(xì)胞間信號(hào)

16、傳導(dǎo)中發(fā)揮作用。有研究證實(shí)，CD147也是CyPB的細(xì)胞膜受體，CD147抗體可阻斷CyPB介導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞趨化[24]。Allain等發(fā)現(xiàn)，CyPB可通過促進(jìn)T細(xì)胞膜上α4β1和α4β7整合素的活化而增強(qiáng)T細(xì)胞向細(xì)胞外基質(zhì)的粘附，T細(xì)胞膜上的CD147是這一信號(hào)傳導(dǎo)過程中不可缺少的協(xié)同刺激分子[18]。 </p><p>　　小干擾RNA(siRNA)是一種新近發(fā)現(xiàn)的誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)特定基因沉默的技術(shù)。它通過向細(xì)胞

17、內(nèi)導(dǎo)入長(zhǎng)度為21-23的核苷酸序列，高度特異性地降解同源mRNA序列，從而有效地阻止相應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)。近年的研究發(fā)現(xiàn)，將目標(biāo)基因siRNA轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)T細(xì)胞是一種有效的基因治療手段，在艾滋病等免疫相關(guān)性疾病中有很好的臨床運(yùn)用前景[25，26]。本研究組也于近期成功構(gòu)建CD147 siRNA 表達(dá)載體，將它轉(zhuǎn)染惡性黑色素瘤細(xì)胞后可有效抑制CD147的表達(dá)[27，28]，從而為項(xiàng)目的順利開展奠定了很好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。</p>&l

18、t;p>　　因?yàn)槿狈硐氲膭?dòng)物模型，對(duì)銀屑病發(fā)病機(jī)制的研究大多停留在體外實(shí)驗(yàn)階段。嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷鼠（SCID鼠）因其獨(dú)有的細(xì)胞和體液免疫缺陷特點(diǎn)，而被廣泛運(yùn)用于腫瘤學(xué)和器官移植等科研領(lǐng)域。有研究發(fā)現(xiàn)，將銀屑病患者皮膚移植到SCID鼠身上，有很高的移植存活率，且能較好地保存銀屑病的臨床、組織病理和免疫學(xué)特點(diǎn)[29,30]。因此，人銀屑病皮損-SCID鼠移植模型被公認(rèn)為目前最好的銀屑病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。</p><p

19、>　　國(guó)外有研究發(fā)現(xiàn)，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)滑液中CyPA的水平和反應(yīng)性中性粒細(xì)胞上CD147的表達(dá)水平與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)[31]，國(guó)內(nèi)也有研究證實(shí)，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜組織的中性粒細(xì)胞和T細(xì)胞中有增高表達(dá)的CD147分子[32]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在銀屑病患者的血清中CypA自身抗體的水平明顯增高[33]，但國(guó)內(nèi)外尚無有關(guān)CD147分子及其配體，CyPA和CyPB在銀屑病發(fā)病機(jī)制中作用的報(bào)道。</p><p>　

20、　本研究中，我們將首先了解CD147分子及其配體CyPA和CyPB在Jurkat T細(xì)胞，銀屑病患者外周血炎癥細(xì)胞和皮損中的表達(dá)情況；然后通過CD147 siRNA技術(shù)明確CD147分子在Jurkat T細(xì)胞和銀屑病患者T細(xì)胞增殖、活化及基質(zhì)黏附過程中的作用，以及在CyPA和CyPB介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞趨化過程中的作用；最后建立人銀屑病皮損-SCID鼠移植動(dòng)物模型，并通過該模型進(jìn)一步明確CD147 siRNA能否在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)條件下緩解銀屑病皮

21、損發(fā)展的進(jìn)程。本研究的最終目的在于，明確CD147分子在銀屑病T細(xì)胞活化和基質(zhì)黏附以及中性粒細(xì)胞趨化等重要發(fā)病環(huán)節(jié)中的作用和機(jī)制，明確CD147 siRNA對(duì)人銀屑病皮損-SCID鼠移植模型的效應(yīng)，為探尋銀屑病新的研究領(lǐng)域和治療方法提供理想的靶分子。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　Schaerli P, Britschgi M, K

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48、t;/p><p>　　李衛(wèi)平，謝震山，康向東等，銀屑病和SLE患者血清抗親環(huán)素A抗體的檢測(cè)及意義。上海免疫學(xué)雜志，2001，21：17。</p><p>　　2、項(xiàng)目的研究?jī)?nèi)容、研究目標(biāo),以及擬解決的關(guān)鍵問題。</p><p><b>　　2.1研究?jī)?nèi)容</b></p><p>　?。?） 運(yùn)用免疫印跡和RT-PCR方法檢測(cè)

49、Jurkat T細(xì)胞，銀屑病患者外周血T細(xì)胞及中性粒細(xì)胞中CD147表達(dá)水平，Jurkat 和外周血T 細(xì)胞中CyPA和CyPB表達(dá)水平。</p><p>　?。?） 運(yùn)用免疫組化法觀察CD147，CyPA和CyPB在銀屑病皮損中的表達(dá)和分布特點(diǎn)及其與病情的相關(guān)性。</p><p>　?。?） 構(gòu)建pSUPER/CD147siRNA質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染銀屑病患者外周血T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和Jurkat

50、 T細(xì)胞。</p><p>　　（4） 運(yùn)用免疫學(xué)常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法觀察CD147 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)Jurkat 和銀屑病患者T細(xì)胞增殖、活化及基質(zhì)黏附作用的影響。</p><p>　?。?） 運(yùn)用中性粒細(xì)胞趨化性實(shí)驗(yàn)（Boyden chamber實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)）觀察CD147 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)由CyPA和CyPB介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞趨化性的影響。</p><p>　?。?） 建立

51、銀屑病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型（人銀屑病皮損-SCID鼠移植模型），并利用局部注射CD147siRNA轉(zhuǎn)染Jurkat T細(xì)胞和患者自體炎癥細(xì)胞的方法來觀察其對(duì)移植皮損的臨床表現(xiàn)，組織病理和免疫學(xué)特點(diǎn)的影響。</p><p><b>　　2.2研究目標(biāo)</b></p><p>　　（1） 了解CD147分子及其配體CyPA和CyPB在Jurkat T細(xì)胞，銀屑病外周血炎癥細(xì)胞和皮

52、損中的表達(dá)情況。</p><p>　　（2） 通過CD147 siRNA技術(shù)明確CD147在Jurkat 和銀屑病患者T細(xì)胞增殖、活化及基質(zhì)黏附過程中的作用，及在CyPA和CyPB介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞趨化過程中的作用。</p><p>　?。?） 建立銀屑病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，并通過該模型進(jìn)一步明確CD147 siRNA能否在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)條件下緩解銀屑病皮損發(fā)展的進(jìn)程。</p><p

53、>　?。?） 結(jié)合本研究和我們前期研究結(jié)果，明確CD147分子在銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖和分化、T細(xì)胞活化和基質(zhì)黏附以及中性粒細(xì)胞趨化等重要發(fā)病環(huán)節(jié)中的作用和機(jī)制，為探尋銀屑病新的研究領(lǐng)域和治療方法提供理想的靶分子。</p><p>　　2.3擬解決的關(guān)鍵問題</p><p>　?。?） pSUPER/CD147siRNA質(zhì)粒的構(gòu)建及其細(xì)胞內(nèi)的成功轉(zhuǎn)染（干擾有效性）；</p&

54、gt;<p>　?。?） 銀屑病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型（人銀屑病皮損-SCID鼠移植模型）的建立；</p><p>　?。?） CD147分子在銀屑病多個(gè)重要發(fā)病環(huán)節(jié)中的作用和機(jī)制，及其在銀屑病治療領(lǐng)域的開發(fā)運(yùn)用前景。</p><p>　　3、擬采取的研究方案及可行性分析。</p><p><b>　　3.1 研究方法</b></p&

55、gt;<p>　　3.1.1 研究對(duì)象</p><p>　　收集在中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院三家附屬醫(yī)院皮膚科初次就診，近三個(gè)月來未經(jīng)任何系統(tǒng)和局部治療的尋常型銀屑病患者40例和膿皰型銀屑病患者15例，同時(shí)收集20例健康人作對(duì)照。患者經(jīng)皮膚活檢進(jìn)一步明確臨床診斷，并對(duì)銀屑病分型和疾病嚴(yán)重程度（PASI積分）進(jìn)行臨床評(píng)估。</p><p>　　3.1.2 Jurkat 和外周血T細(xì)胞及

56、中性粒細(xì)胞中CD147表達(dá)水平的檢測(cè)</p><p>　　A．細(xì)胞株：人Jurkat T細(xì)胞株從中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物所購(gòu)入，菜用含10% FCS的PPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。</p><p>　　B．外周血T細(xì)胞的分離：采用密度梯度離心法分離40例尋常型銀屑病患者、15例膿皰型銀屑病患者和對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞并用E-玫瑰花結(jié)法或免疫磁珠法純化T細(xì)胞，用PBS洗滌3次,離心后重懸浮于含

57、10% FCS的PPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)備用（部分細(xì)胞中加PHA刺激）。</p><p>　　C．外周血中性粒細(xì)胞的分離：采用Polymorphprep分離液的梯度離心法分離40例尋常型銀屑病患者、20例膿皰型銀屑病患者和對(duì)照組外周血中性粒細(xì)胞,用PBS洗滌3次, 離心后懸浮于含10% FCS的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)備用。 </p><p>　　D．免疫印跡法檢測(cè)CD147的蛋白表達(dá)水

58、平：提取Jurkat T細(xì)胞，患者T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分離，電轉(zhuǎn)膜 至PVDF膜上，經(jīng)封閉后依次加入兔抗人CD147抗體(日本抗體學(xué)會(huì)制備，鹿大皮膚科贈(zèng)送)，辣根過氧化物酶標(biāo)二抗，最后經(jīng)ECL系統(tǒng)顯色，圖像分析（Adobe Photoshop）。</p><p>　　E．RT-PCR法檢測(cè)CD147的mRNA表達(dá)水平：用Trizol提取Jurkat T細(xì)胞，患者T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞RNA（按

59、說明書進(jìn)行），定量后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄用于PCR，CD147上游引物：5'-GCAGCGGTTGGAGGTTGT-3'；下游引物：5'-AGCCACGATGCCCAGGAAGG-3'，建立25μl PCR反應(yīng)體系，94℃ 4min, 94℃ 50s ,65℃ 50s,72℃ 1min 20s,72℃ 10 min ,循環(huán)數(shù)35次。</p><p>　　3.1.3 Jurk

60、at 和外周血T細(xì)胞中CyPA和CyPB表達(dá)水平的檢測(cè)</p><p>　　A．免疫印跡法檢測(cè)CyPA和CyPB的蛋白表達(dá)水平：除兔抗人CyPA和CyPB抗體(購(gòu)自Bioreagents公司)不同外，方法與3.1.2 D相同。</p><p>　　B．RT-PCR法檢測(cè)CyPA和CyPB的mRNA表達(dá)水平：RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄同前，CyPA上游引物：5'-CACCGTGTTCTTCG

61、ACATTG-3'；CyPA下游引物：5'- CCATGGCCTCCACAATATTC -3'，CyPB上游引物：5'- GGAGATGGCACAGGAGGAAAG -3'；CyPB下游引物：5'- AAGAAACTCACTGGCAGACACG -3'，建立25μlPCR反應(yīng)體系，94℃ 4min, 94℃ 50s ,60℃ 1min50s,72℃ 1min30s, 72℃ 10

62、min ,循環(huán)數(shù) 36次。</p><p>　　3.1.4 患者皮損中CD147，CyPA和CyPB表達(dá)和分布特點(diǎn)的檢測(cè)</p><p>　　皮膚活檢取患者皮損和非皮損區(qū)皮膚及對(duì)照組皮膚制備石蠟包埋標(biāo)本，連續(xù)切片，采用免疫組化法分別觀察CD147，CyPA和CyPB在皮膚組織角質(zhì)形成細(xì)胞，淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等細(xì)胞成分中的表達(dá)和分布特點(diǎn)，并分析其與標(biāo)本來源，銀屑病分型和疾病嚴(yán)重程度間的關(guān)

63、系。</p><p>　　3.1.5 pSUPER/CD147siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Jurkat T細(xì)胞，患者外周血T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞</p><p>　　A.材料與試劑：質(zhì)粒pSUPER由我院眼科夏曉波教授惠贈(zèng)，質(zhì)粒抽提及凝膠回收試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，RT-PCR試劑盒購(gòu)自晶美公司，T4DNA連接酶及限制性內(nèi)切酶HindⅢ 和BglⅡ 購(gòu)自Promega公司，轉(zhuǎn)染試劑lipofacta

64、mine 2000 購(gòu)自美國(guó)invitrogen公司，大腸埃希菌DH5α由我校病原微生物教研室提供。</p><p>　　B.shRNA 的設(shè)計(jì)和構(gòu)建：（1）shRNA 設(shè)計(jì)：根據(jù)shRNA設(shè)計(jì)原則和CD147編碼序列，設(shè)計(jì)19-21nt的DNA片段，并利用Blast進(jìn)行匹配，以確定選定的序列為特異性的序列，設(shè)計(jì)合成2-4條CD147編碼序列的反向重復(fù)序列，如：5’- GATCCCCGTCGTCAGAACACAT

65、CAACTTCAAGAGAGTTGATGTGTTCTGACGACTTTTTGGAAA-3’和5’- AGCTTTTCCAAAAAGTCGTCAGAACACATCAACTCTCTTGAAGTTGATGTGTTCTGACGACGGG-3’,中間為9個(gè)插入序列TTCAAGAGA。合成的DNA兩端設(shè)計(jì)有HindⅢ 和BglⅡ的酶切位點(diǎn)，便于與pSUPER載體相連接。（2）雙鏈DNA的形成：分別取1μl 3mg/ml 合成的DNA片段，在48μl

66、退伙緩沖溶液中逐步降溫退伙形成雙鏈：94℃ 4分鐘， 80℃ 4分鐘， 75℃ 4分鐘， 70℃ 10分鐘，37℃20分鐘，最后降到4℃ 保存。（3）shRNA的構(gòu)建：退火形成的雙鏈與HindⅢ 和BglⅡ的酶切線形化后的pSUPER在T4DNA 連接酶的作用下形成</p><p>　　C.轉(zhuǎn)染細(xì)胞:大量抽提重組質(zhì)粒pSUPER/CD147siRNA，并進(jìn)行DNA定量。待培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)70-80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，

67、轉(zhuǎn)染試劑lipofactamine 2000 與質(zhì)粒DNA按1：5進(jìn)行轉(zhuǎn)染,同時(shí)設(shè)pSUPER空白載體和正常細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4-6小時(shí)后棄培養(yǎng)液，加入含血清和抗生素的培養(yǎng)液，第2天加入puromycine篩選。</p><p>　　D.建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞:（1） 確定篩選細(xì)胞的最佳puromycine的濃度：在生長(zhǎng)狀態(tài)良好的培養(yǎng)細(xì)胞中加入不同濃度的puromycine,觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況

68、，保持生長(zhǎng)的最低puromycine濃度即為篩選的最佳濃度。（2）轉(zhuǎn)染細(xì)胞的puromycine篩選：加入最佳濃度的puromycine進(jìn)行篩選，至正常細(xì)胞全部死亡，并長(zhǎng)出單個(gè)克隆為止。（3）單克隆的挑取和擴(kuò)增：將待篩選的細(xì)胞單克隆挑入24孔板中培養(yǎng)，長(zhǎng)滿后傳入培養(yǎng)瓶中批量擴(kuò)增。</p><p>　　E . 免疫印跡法和RT-PCR檢測(cè)CD147的表達(dá)并確定抑制效果:方法同3.1.2 D,E。</p>

69、<p>　　3.1.6 轉(zhuǎn)染CD147siRNA對(duì)Jurkat 和患者T細(xì)胞增殖和活化的影響</p><p>　　A. T細(xì)胞增殖狀況的檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)分未轉(zhuǎn)染、空白載體轉(zhuǎn)染和CD147siRNA轉(zhuǎn)染的Jurkat/患者T細(xì)胞（各1×106 個(gè)細(xì)胞）等六組，經(jīng)PHA刺激后，于37℃下培養(yǎng)72小時(shí)，用常規(guī)MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。</p><p>　　B. T細(xì)胞活化狀況

70、的檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)分組同上，經(jīng)PHA刺激后，于37℃下培養(yǎng)72小時(shí)，采用經(jīng)典的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，并檢測(cè)IL-2和γ-干擾素來了解T細(xì)胞活化狀況。</p><p>　　3.1.7 轉(zhuǎn)染CD147siRNA對(duì)Jurkat 和患者T細(xì)胞基質(zhì)黏附作用的影響</p><p>　　在無菌96孔板中加入纖維結(jié)合蛋白（1 μg/100 μl/每孔），經(jīng)4℃過夜固化，包被并用0.5% BSA封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)

71、。加入的細(xì)胞分未轉(zhuǎn)染、空白載體轉(zhuǎn)染和CD147siRNA轉(zhuǎn)染的Jurkat/患者T細(xì)胞（各1×106 個(gè)細(xì)胞）等六組，經(jīng)37℃ 孵育半小時(shí)后，倒去培養(yǎng)液，并用PBS洗去未黏附的T細(xì)胞。每孔加入25 L MTT(終濃度5 moL/L)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入DMSO100 uL，震蕩10 min，待紫藍(lán)色顆粒完全溶解，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀以490 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)，測(cè)各孔的A490值，并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線量化黏附的T細(xì)胞數(shù)量（每組3個(gè)，重復(fù)三

72、次，計(jì)數(shù)平均值）。</p><p>　　3.1.8 轉(zhuǎn)染CD147siRNA對(duì)由CyPA和CyPB介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞趨化性的影響</p><p>　　中性粒細(xì)胞趨化性實(shí)驗(yàn)仍采用我們?cè)晒τ糜跈z測(cè)皮膚腫瘤細(xì)胞遷移情況（國(guó)家自然科學(xué)基金，30200248）的博伊登室（Boyden chamber）實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，并作適當(dāng)改動(dòng)。博伊登室由上室和下室組成，上、下室由不含聚維酮的聚碳酸酯膜分隔，膜上有3-

73、µm小孔，可通過趨化的中性粒細(xì)胞。上室中加入的細(xì)胞分為未轉(zhuǎn)染、空白載體轉(zhuǎn)染和CD147siRNA轉(zhuǎn)染的中性粒細(xì)胞等三組，下室分為不加T細(xì)胞、加Jurkat/患者T細(xì)胞和加入經(jīng)CyPA或CyPB抗體處理的Jurkat/患者T細(xì)胞七組。37℃ 孵育1小時(shí)后取下聚碳酸酯膜，采用膜染色細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)膜底面的中性粒細(xì)胞數(shù)（每組3個(gè)，重復(fù)三次，計(jì)數(shù)平均值）。</p><p>　　3.1.9 人銀屑病皮損-SCID

74、鼠移植模型的建立</p><p>　　十位尋常型銀屑病患者的新鮮皮損（五位健康成人皮膚為對(duì)照）將作為供體使用，選擇6-8周的SCID鼠為移植受體。每位供體取七塊0.8×0.8cm大小皮片（銀屑病皮損的臨床表現(xiàn)相同）分別移植于七只SCID鼠背部，單線可吸收縫合，無菌紗布覆蓋直至10天后愈合。</p><p>　　3.1.10 移植皮片內(nèi)細(xì)胞注射及組織學(xué)分析</p>

75、<p>　　移植后第3周根據(jù)移植皮損的鱗屑多少、隆起和紅斑情況對(duì)其進(jìn)行臨床積分評(píng)價(jià)（分為0-3分四級(jí)）。移植后第3周和第4周將用PBS稀釋的細(xì)胞（200μl）注射到移植皮損的皮下（Jurkat 細(xì)胞組僅于第4周注射1次）。注射分七組：生理鹽水組；Jurkat 細(xì)胞組；CD147siRNA轉(zhuǎn)染Jurkat 細(xì)胞組；供體T細(xì)胞組；供體CD147siRNA轉(zhuǎn)染T細(xì)胞組；供體中性粒細(xì)胞組和供體CD147siRNA轉(zhuǎn)染中性粒細(xì)胞組。移植

76、后第6周再次對(duì)皮損進(jìn)行臨床積分評(píng)價(jià)并作前后比較，處死SCID鼠，將移植皮損行石蠟包埋，切片。組織學(xué)分析包括：表皮厚度；角化不全發(fā)生情況；表皮中上層中性粒細(xì)胞聚集和Munro微膿瘍形成情況；真皮淺層血管周圍單一核炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況，并進(jìn)行Ki-67（反映角質(zhì)形成細(xì)胞增殖情況）、CD3(T細(xì)胞標(biāo)記)和CD15(中性粒細(xì)胞標(biāo)記)的免疫組化檢測(cè)。</p><p><b>　　3.2 技術(shù)路線</b>&

77、lt;/p><p><b>　　3.3 可行性分析</b></p><p>　　我校三家附屬醫(yī)院皮膚科每年超過20萬患者的門診量可以為本研究的標(biāo)本來源提供可靠的保證。</p><p>　　項(xiàng)目申請(qǐng)者于1998年開始會(huì)同日本鹿兒島大學(xué)皮膚科金藏拓郎副教授（Basigin/CD147分子的發(fā)現(xiàn)者之一）在國(guó)際上率先開展了CD147在正常皮膚及皮膚腫瘤中作

78、用及機(jī)制的系列研究，先后獲得包括兩項(xiàng)國(guó)家自然科學(xué)基金在內(nèi)的多項(xiàng)國(guó)內(nèi)外科研課題資助，取得了五個(gè)創(chuàng)新性的科研成績(jī)，在國(guó)內(nèi)外發(fā)表相關(guān)論文10篇（其中SCI論文3篇）(詳見工作基礎(chǔ)和申請(qǐng)人簡(jiǎn)歷)。本項(xiàng)目組的主要成員都曾先后參加過以上工作，為本研究的開展奠定了堅(jiān)實(shí)的人員、理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)驗(yàn)。</p><p>　　本項(xiàng)目主要涉及的細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，siRNA技術(shù)和人銀屑病皮損-SCID鼠移植模型均為世界公認(rèn)的成熟技術(shù)，沒有

79、過高的技術(shù)難度。本項(xiàng)目組已成功構(gòu)建人CD147 siRNA 表達(dá)載體并已鑒定了CD147siRNA轉(zhuǎn)染的有效性，從而為本項(xiàng)目的順利開展奠定了堅(jiān)實(shí)的技術(shù)基礎(chǔ)(詳見工作基礎(chǔ)和申請(qǐng)人簡(jiǎn)歷)。我們的RT-PCR預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在3例尋常型銀屑病患者和1例膿皰型銀屑病患者外周血T細(xì)胞中均有CD147和CyPA的增高表達(dá)(詳見工作基礎(chǔ))。本項(xiàng)目組有開展裸鼠實(shí)驗(yàn)的成功經(jīng)驗(yàn)（國(guó)家自然科學(xué)基金，30200248），SCID鼠已先期從中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)進(jìn)

80、五只，并已準(zhǔn)備開始建立人銀屑病皮損-SCID鼠移植模型的預(yù)實(shí)驗(yàn)。</p><p>　　本項(xiàng)目細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)將在我校腫瘤學(xué)衛(wèi)生部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、國(guó)家遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室及鹿大醫(yī)學(xué)部皮膚科實(shí)驗(yàn)室開展。以上三家實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)力量及實(shí)驗(yàn)條件均已達(dá)到國(guó)內(nèi)乃至國(guó)際先進(jìn)水平。為確保本項(xiàng)目順利開展，本課題組成員（顏克香）將于今年下半年以共同培養(yǎng)博士生身份，由鹿大皮膚科邀請(qǐng)赴日開展本項(xiàng)目的預(yù)備實(shí)驗(yàn)。課題實(shí)施期間，雙方人員將依據(jù)近

81、八年合作的慣例，定期互訪，交流實(shí)驗(yàn)進(jìn)展情況并開展討論。</p><p>　　基于以上所述，我們認(rèn)為本項(xiàng)目在實(shí)驗(yàn)材料、人員、理論和具體操作等方面有相當(dāng)扎實(shí)的基礎(chǔ)，科研構(gòu)思充分體現(xiàn)了科研工作的延續(xù)性，準(zhǔn)備充分，是切實(shí)可行的。</p><p>　　4、本項(xiàng)目的特色與創(chuàng)新之處。</p><p>　　經(jīng)檢索1990年以來文獻(xiàn)證實(shí)，本項(xiàng)目∶</p><p&g

82、t;　?。?）在國(guó)內(nèi)外首次將CD147分子引入銀屑病的科研領(lǐng)域；并首次探討CD147分子與其配體CyPA和CyPB在銀屑病發(fā)病諸多環(huán)節(jié)的作用機(jī)制及其相互關(guān)系。</p><p>　　（2）在國(guó)內(nèi)外首次運(yùn)用CD147siRNA技術(shù)研究該分子在人活體細(xì)胞（T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞）中的作用機(jī)制。</p><p>　?。?）在國(guó)內(nèi)首次建立人銀屑病皮損-SCID鼠移植模型這一銀屑病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。</

83、p><p>　　5、年度研究計(jì)劃及預(yù)期研究結(jié)果。</p><p>　　5.1 年度研究計(jì)劃</p><p>　　2006年1月至2006年12月：</p><p>　　收集病例及臨床資料，石蠟標(biāo)本制作。HE染色，明確病例診斷、分型和疾病嚴(yán)重程度判斷。完成免疫組化實(shí)驗(yàn)及結(jié)果觀察、分析。整理資料，完成論文1篇。完成免疫印跡和RT-PCR方法檢測(cè)CD1

84、47、CyPA和CyPB表達(dá)水平的預(yù)實(shí)驗(yàn)，初步構(gòu)建pSUPER/CD147 siRNA質(zhì)粒。</p><p>　　2007年1月至2007年12月：</p><p>　　完成pSUPER/CD147siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)并鑒定干擾效果。觀察CD147 siRNA對(duì)T細(xì)胞增殖、活化及基質(zhì)黏附作用的影響，以及對(duì)由CyPA和CyPB介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞趨化性的影響。整理資料，完成論文2-3篇。完

85、成銀屑病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立的預(yù)實(shí)驗(yàn)。參加國(guó)際學(xué)術(shù)會(huì)議一次，中日研究人員互訪一次，交流研究成果，商討下一步實(shí)驗(yàn)方案。</p><p>　　2008年1月至2008年6月： </p><p>　　完成動(dòng)物實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及組織學(xué)和免疫組化分析。</p><p>　　2008年7月至2008年12月：</p><p>　　整理全部資料，再完成論文2篇，完成結(jié)

86、題總結(jié)報(bào)告并準(zhǔn)備申報(bào)科研成果。</p><p>　　5.2 預(yù)期研究結(jié)果</p><p>　　1．完成論文5-6篇，其中1-2篇有望發(fā)表于國(guó)外知名皮膚病學(xué)雜志；</p><p>　　2．明確CD147分子在銀屑病T細(xì)胞活化和基質(zhì)黏附以及中性粒細(xì)胞趨化等重要發(fā)病環(huán)節(jié)中的作用和機(jī)制；</p><p>　　3．明確CD147 siRNA對(duì)人銀屑病皮

87、損-SCID鼠移植模型的效應(yīng)；</p><p>　　4．為探尋銀屑病新的科研領(lǐng)域和治療方法提供原創(chuàng)性的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理想的靶分子； </p><p>　　5．培養(yǎng)皮膚科專業(yè)博士畢業(yè)生1-2名，碩士畢業(yè)生2-3名；</p><p>　　6．總結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，申報(bào)科研成果。</p><p>　　（二）研究基礎(chǔ)與工作條件</p><p&

88、gt;<b>　　1、工作基礎(chǔ)</b></p><p>　　Basigin/CD147分子于1990年由本項(xiàng)目的主要參與者，鹿大皮膚科金藏拓郎副教授首次克隆成功。本項(xiàng)目的申請(qǐng)者于1997年赴鹿大皮膚科攻讀博士學(xué)位，并與金藏拓郎副教授一起首次將CD147分子引入皮膚科科研領(lǐng)域。在日留學(xué)期間及回國(guó)工作后，申請(qǐng)者一直在日本皮膚科國(guó)際學(xué)術(shù)交流基金和中國(guó)國(guó)家自然科學(xué)基金（30040028，302002

89、48）等項(xiàng)目的資助下，堅(jiān)持開展了CD147在正常皮膚及皮膚腫瘤中作用及機(jī)制的系列研究，研究?jī)?nèi)容曾先后于七次國(guó)際會(huì)議交流9次（JIMRO International Symposium on CD147, 1998，日本; JSID 24th Annual Meeting, 1999，日本; JSID 25th Annual Meeting, 2000，日本; CEMSJ 32th Annual Meeting, 2000, 日本;

90、 第100次日本皮膚科學(xué)會(huì), 2001; 62nd Annual Meeting of SID, 2001, 美國(guó)；The 7th China-Japan Joint Meeting of Dermatology，中國(guó)）。</p><p>　　申請(qǐng)者有關(guān)CD147的系列研究的主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)為(參考文獻(xiàn)詳見申請(qǐng)人簡(jiǎn)歷)：1. 在國(guó)際上率先證實(shí)了Basigin/CD147分子與生理和病理狀態(tài)下角質(zhì)形成細(xì)胞分化狀態(tài)相關(guān)

91、;2. 在國(guó)際上率先證實(shí)了Basigin/CD147分子在細(xì)胞膜上的超微分布特點(diǎn);3. 首次明確了Basigin/CD147分子在皮膚腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過程中的分子機(jī)制。4. 首次提出了皮膚基底細(xì)胞癌可能來源于早期胚胎表皮基底細(xì)胞的新理論。5. 率先制備了人CD147分子基因的真核表達(dá)載體及siRNA 表達(dá)載體。</p><p>　　以本項(xiàng)目以上兩名成員為主的實(shí)驗(yàn)組是迄今為止世界上唯一開展CD147分子在皮膚科領(lǐng)域相

92、關(guān)研究的工作群體，多年來一直與發(fā)現(xiàn)CD147另一人源同源分子EMMPRIN的美國(guó)Biswas實(shí)驗(yàn)室保持著良好的合作關(guān)系，近年來項(xiàng)目申請(qǐng)者還先后應(yīng)邀幫助美國(guó)Martin實(shí)驗(yàn)室和法國(guó)Daniel實(shí)驗(yàn)室建立與CD147分子有關(guān)的科研體系。因此，已在此領(lǐng)域擁有了相當(dāng)?shù)膰?guó)際知名度和導(dǎo)向力。</p><p>　　考慮到RNA干擾技術(shù)在近兩年來逐漸成熟，作為一種逆向干預(yù)措施，在許多方面相對(duì)反義寡核苷酸技術(shù)更有優(yōu)勢(shì)，為更好地完成

93、在研國(guó)家自然科學(xué)基金（30200248），我們已成功構(gòu)建和鑒定了CD147 siRNA 表達(dá)載體并證實(shí)其轉(zhuǎn)染能有效抑制黑色素瘤細(xì)胞中CD147的表達(dá)（詳見下圖），以替代原擬采用的反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染技術(shù)。這也為本申請(qǐng)項(xiàng)目的順利完成奠定了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。</p><p>　　1 2 3 4 5 6</p><p>　　圖１　重組質(zhì)粒pSUPER/CD147siRNA酶切鑒

94、定圖</p><p><b>　　１：Marker </b></p><p>　?。玻褐亟M質(zhì)粒pSUPER/CD147 siRNA</p><p>　　３：BglⅡ單酶切重組質(zhì)粒pSUPER/CD147 siRNA</p><p>　?。矗篐ind Ⅲ單酶切重組質(zhì)粒pSUPER/CD147 siRNA</p>

95、<p>　?。担篐ind Ⅲ 和 BglⅡ雙酶切重組質(zhì)粒pSUPER/CD147 siRNA</p><p>　?。叮篐ind Ⅲ 和EcoRⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pSUPER/CD147 siRNA</p><p>　　1 2 3 4 5 6</p><p>　　圖2 RT-PCR檢測(cè)黑色素瘤細(xì)胞（A37

96、5）中CD147的表達(dá) </p><p><b>　　1：Marker</b></p><p>　　2：未轉(zhuǎn)染黑色素瘤細(xì)胞（CD147：692bp; β肌動(dòng)蛋白：450bp）</p><p>　　3：空白質(zhì)粒pSUPER轉(zhuǎn)染黑色素瘤細(xì)胞</p><p>　　4：重組質(zhì)粒pSUPER/CD147 siRNA(seq1)轉(zhuǎn)

97、染黑色素瘤細(xì)胞</p><p>　　5：未轉(zhuǎn)染黑色素瘤細(xì)胞</p><p>　　6：重組質(zhì)粒pSUPER/CD147 siRNA(seq2)轉(zhuǎn)染黑色素瘤細(xì)胞</p><p>　　為進(jìn)一步明確本項(xiàng)目的可行性，我們通過RT-PCR預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了3例尋常型銀屑病患者、1例膿皰型銀屑病患者和2名健康人外周血T細(xì)胞中CD147和CyPA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：銀屑病患者外周血T細(xì)

98、胞中CD147和CyPA的表達(dá)水平較健康人顯著增高。</p><p>　　1 2 3 4 5 </p><p>　　圖5 RT-PCR檢測(cè)銀屑病患者和健康人外周血T細(xì)胞中CD147和CyPA表達(dá)</p><p><b>　　1：Marker</b></p><p>　　

99、2：健康人外周血T細(xì)胞中CyPA表達(dá)</p><p>　　3：銀屑病患者外周血T細(xì)胞中CyPA表達(dá)</p><p>　　4：銀屑病患者外周血T細(xì)胞中CD147表達(dá)</p><p>　　5：健康人外周血T細(xì)胞中CD147表達(dá)</p><p><b>　　2、工作條件</b></p><p>　　本科

100、室實(shí)驗(yàn)室已具備本項(xiàng)目免疫組化及細(xì)胞培養(yǎng)所需的實(shí)驗(yàn)條件和設(shè)備∶切片機(jī)，普通顯微鏡，普通及深低溫冰箱，超凈工作臺(tái)，CO2培養(yǎng)箱等。</p><p>　　本項(xiàng)目的細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)將在我校腫瘤學(xué)衛(wèi)生部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室及鹿大醫(yī)學(xué)部皮膚科實(shí)驗(yàn)室開展。以上三處均系開放型實(shí)驗(yàn)室，具有先進(jìn)、齊備的細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)條件。</p><p>　　本項(xiàng)目的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)將在我校設(shè)施

101、完備的醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心開展。</p><p>　　因此，本項(xiàng)目所需的實(shí)驗(yàn)條件完備，無需購(gòu)買大型儀器、設(shè)備。</p><p><b>　　3、申請(qǐng)人簡(jiǎn)歷</b></p><p>　　4、承擔(dān)科研項(xiàng)目情況</p><p>　　項(xiàng)目來源：國(guó)家自然科學(xué)基金</p><p>　　項(xiàng)目名稱∶惡性黑色素瘤細(xì)胞中

102、Basigin/CD147的作用及機(jī)制研究</p><p>　　批準(zhǔn)號(hào)∶ 30200248 負(fù)責(zé)內(nèi)容：</p><p>　　起止年月：2003年1月 - 2005年12月</p><p>　　目前，該項(xiàng)目的完成情況良好，實(shí)驗(yàn)部分的工作已基本完成。</p><p>　　已發(fā)表論文4篇(詳見工作基礎(chǔ)和申請(qǐng)人簡(jiǎn)歷)，其

103、中一篇發(fā)表在腫瘤學(xué)領(lǐng)域的國(guó)際知名期刊Int J Cancer (IF:4.2)并被SCI收錄的國(guó)際英文論文引用20余次;其余3篇中的兩篇發(fā)表于中華皮膚科雜志；接受待發(fā)表論文1篇（中華皮膚科雜志）；投稿論文一篇（Int J Cancer）。</p><p>　　迄今已有五名研究生直接參入本項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)，并已培養(yǎng)兩名碩士研究生畢業(yè)。</p><p>　　依據(jù)本項(xiàng)目和已完成國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30

104、040028）的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們已申報(bào)“Basigin在正常皮膚及皮膚腫瘤中的作用及機(jī)制研究”科技成果，并通過湖南省衛(wèi)生廳組織的成果鑒定（見附件2），在9位國(guó)內(nèi)同行專家的函審意見中：2位認(rèn)為達(dá)到國(guó)際領(lǐng)先水平，7位認(rèn)為達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平。目前正在逐級(jí)申報(bào)科技獎(jiǎng)。</p><p>　　在研項(xiàng)目側(cè)重于闡明Basigin/CD147在惡性黑色素瘤中可能的作用和分子機(jī)制（黑色素瘤細(xì)胞膜上增高表達(dá)的CD147分子通過刺激腫瘤細(xì)胞

105、周圍成纖維細(xì)胞表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移），其研究成果是本申請(qǐng)項(xiàng)目的基礎(chǔ)，本申請(qǐng)項(xiàng)目是在研項(xiàng)目的原創(chuàng)性延伸和發(fā)展，兩者無內(nèi)容重復(fù)。</p><p>　　5、完成自然科學(xué)基金項(xiàng)目情況</p><p>　　項(xiàng)目名稱∶Basigin在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)、超微定位及意義</p><p>　　批準(zhǔn)號(hào)∶ 30040028 負(fù)責(zé)人：

106、</p><p>　　起止年月2000年9月 - 2001年9月</p><p>　　該項(xiàng)目已在預(yù)定時(shí)間內(nèi)完成了全部預(yù)期計(jì)劃。為提高相關(guān)理論的系統(tǒng)性和全面性，我們還通過科學(xué)地利用有限的科研經(jīng)費(fèi)和爭(zhēng)取國(guó)際合作的多種途徑，增加了有關(guān)Basigin/CD147在正常皮膚和BCC中表達(dá)和意義及皮膚SCC轉(zhuǎn)移灶中MMPs和CD147表達(dá)和意義等科研內(nèi)容。研究成果先后五次于日本研究皮膚科學(xué)會(huì)，日本臨床

107、電子顯微鏡學(xué)會(huì)，日本皮膚科學(xué)會(huì)和美國(guó)研究皮膚科學(xué)會(huì)等世界知名的國(guó)際學(xué)術(shù)會(huì)議七篇發(fā)表（口頭報(bào)告三次，學(xué)術(shù)展示四次）；超過原計(jì)劃（二篇），發(fā)表學(xué)術(shù)論文五篇，其中兩篇分別發(fā)表于被SCI收錄的J Cutaneous Pathology（影響因子為1.6）和Histochemistry and Cell Biology（影響因子為1.8）發(fā)表?；谝陨铣煽?jī)，項(xiàng)目負(fù)責(zé)人于2001年9月被日本研究皮膚科學(xué)會(huì)授于“外籍皮膚科科學(xué)家”獎(jiǎng)。</p&g