1、F18大腸桿菌是目前養(yǎng)豬業(yè)中最普遍、危害最大的腸毒素大腸桿菌病原之一，它可以通過菌毛粘附在小腸上皮細胞上，進而產(chǎn)生腸毒素，引起斷奶仔豬腹瀉(porcinepost-weaningdiarrhea，PWD)。盡管當前對仔豬腹瀉的一些預(yù)防性措施（如提高管理水平、改善衛(wèi)生環(huán)境、注射藥物以及亞單位疫苗接種等），在一定程度上減少了該病的發(fā)生，但并沒有從根本上消除斷奶仔豬腹瀉和水腫病的發(fā)生與流行，采用遺傳學(xué)方法從遺傳本質(zhì)上提高豬對病原的抗性，對開展

2、抗病育種具有治本的功效?？乖幚硐嚓P(guān)轉(zhuǎn)運體（Transporterassociatedantigenprocessing，TAP）（TAP1是TAP蛋白亞基之一）是細菌內(nèi)源性抗原肽（如腸毒素）的運輸載體，在免疫反應(yīng)中起著重要的作用。本試驗對TAP1基因多態(tài)性、基因表達譜和上游序列CpG島甲基化修飾狀態(tài)進行系統(tǒng)檢測，結(jié)合部分免疫應(yīng)答指標的測定，分析和探討TAP1基因的遺傳變異對斷奶仔豬F18大腸桿菌抗性和免疫應(yīng)答能力的關(guān)系，以期為下一步有

3、效分子標記的獲得以及TAP1基因調(diào)控機制的研究奠定基礎(chǔ)。主要試驗結(jié)果如下:
　　 1.采用PCR-RFLP方法對11個豬群體TAP1基因外顯子2的多態(tài)性進行了檢測，共檢測到1個等位基因，AA、AB和BB3種基因型，其中藏豬僅檢測到AB和BB型，其他豬群體中均存在3種基因型。11個群體中等位基因B的頻率為0.44-0.95，總體上等位基因B為優(yōu)勢等位基因。大白豬、長白豬、杜洛克和蘇太豬群體中BB基因型頻率較高，分別為0.906、0

4、.826、0.736、0.603。測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)1個突變位點G729A，為同義突變，沒有引起氨基酸的改變。卡方適合性檢驗結(jié)果顯示:除了蘇太豬和藏豬顯著偏離Hardy-Weinbery平衡(P＜0.01)外，其余豬種均處于Hardy-Weinbery平衡狀態(tài)(P＞0.05)。
　　 2.應(yīng)用熒光定量PCR方法對從初生到斷奶不同日齡（8、19、30和35日齡）、不同豬群體斷奶仔豬（蘇太豬F18抗性型群體、梅山豬和大白豬）、蘇太F18大

5、腸桿菌抗性和敏感型斷奶仔豬的11個組織TAP1基因進行差異表達分析，檢測結(jié)果顯示:TAP1基因在11個不同組織中廣泛表達，在肺、十二指腸、空腸以及免疫組織脾、胸腺、淋巴組織中高度表達，其中肺和空腸表達量最高，表明TAP1基因的表達可能與肺部疾病和腸道疾病的抗性相關(guān)。在不同日齡的仔豬中，8、18、30日齡仔豬TAP1表達水平比較低且無顯著性差異(P＜0.05)，而35日齡的仔豬TAP1表達水平明顯高于前3個日齡段(8、18、30日齡)，其

6、中在肝、胸腺、十二指腸組織中達到顯著水平(P＜0.05)，在脾、肺、淋巴、空腸中達到極顯著水平(P＜0.01)。TAP1基因表達量在易感染F18大腸桿菌時期（35日齡）迅速提升，初步反映了TAP1基因可能與F18大腸桿菌抗性相關(guān)。同時在F18大腸桿菌抗性群和敏感性群中，F(xiàn)18大腸桿菌抗性型的TAP1基因表達量普遍高于敏感型個體的表達量，在各個組織中TAP1表達量差異倍數(shù)從1.430到4.579不等，在胸腺、淋巴結(jié)、空腸、十二指腸中表達差

7、異達到4.579、2.822、2.512、1.892。這進一步表明了TAP1基因可能與F18大腸桿菌抗性相關(guān)。在不同豬群體中，梅山豬和大白豬之間TAP1表達量無顯著性差異，但蘇太豬F18大腸桿菌抗性型群體TAP1表達量明顯高于梅山豬和大白豬，且其中在肝、肺、淋巴結(jié)組織中達到顯著水平(P＜0.05)，在胸腺、脾、十二指腸和空腸組織中達到極顯著水平(P＜0.01)，這一結(jié)果同樣也表明TAP1基因可能與F18大腸桿菌抗性相關(guān)。綜合上述結(jié)果，表

8、明TAP1基因表達量的上調(diào)可能與斷奶仔豬F18大腸桿菌抗性和免疫應(yīng)答有關(guān)。TAP1基因外顯子2G729A變異位點3種基因型個體的表達結(jié)果分析顯示:BB基因型個體TAP1表達量普遍高于AA型和AB型，在脾、肺、腎、胸腺、淋巴結(jié)、十二指腸和空腸組織中，BB基因型TAP1表達量顯著高于AA型和AB型(P＜0.05)，TAP1多態(tài)位點G729A對基因表達具有明顯的調(diào)控作用，BB基因型有可能作為一個重要的抗性分子標記。
　　 3.本研究使

9、用細胞因子酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒，對大白豬、梅山豬和蘇太豬（未選育群體）的IL-2、IL-6、IL-10和IL-12等免疫指標的水平進行了測定，并對其正常值水平進行初步估測。結(jié)果顯示各免疫指標在不同豬種中的平均值差異比較大，這可能與各豬種對疾病抵抗力不同有關(guān)。對比各豬種間的免疫指標水平，發(fā)現(xiàn)大白豬和梅山豬IL-2水平顯著高于蘇太豬（未選育群），而蘇太豬（未選育群）IL-6水平顯著高于大白豬和梅山豬，梅山豬IL-10水平顯著高于

10、蘇太豬(P＜0.05)，3個豬種間IL-12水平無顯著性差異。TAP1基因外顯子2多態(tài)位點G729A對仔豬免疫指標的影響分析結(jié)果顯示:在大白豬中，BB型個體IL-12水平顯著低于AA基因型(P＜0.05)，結(jié)合IL-12功能和大白豬正常值范圍，表明TAP1外顯子2多態(tài)位點BB基因型可能具有較強的一般抗病力。
　　 4.通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)TAP1基因上游調(diào)控區(qū)域存在3個CpG島，通過啟動子區(qū)的預(yù)測，結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點等信息

11、，進一步確定-594到-499為調(diào)控CpG島，針對該位點設(shè)計引物，應(yīng)用BSP方法對TAP1基因調(diào)控區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)進行分析。不同組織中甲基化狀態(tài)分析結(jié)果顯示，該段CpG島甲基化程度極低，僅在空腸中有甲基化，其他組織均處于去甲基化狀態(tài)，表明該GpG島對除空腸外其他組織中的TAP1表達沒有明顯的調(diào)控作用。考慮到F18大腸桿菌主要存在空腸和十二指腸，在接下來的分析主要針對這兩個組織，分析從初生到斷奶不同日齡（8、19、30和35日齡）、不

12、同豬品種斷奶仔豬（蘇太豬F18抗性型群體、梅山豬和大白豬）、蘇太F18大腸桿菌抗性和敏感型斷奶仔豬甲基化狀態(tài)，結(jié)果顯示，僅空腸組織存在甲基化位點，而十二指腸均為去甲基化?？漳c中甲基化程度隨日齡變大而增高，不同豬種間甲基化程度順序為:蘇太豬（抗性群）＞大白豬＞梅山豬，F(xiàn)18大腸桿菌抗性群體中甲基化程度比敏感性群體高，結(jié)合TAP1表達量分析顯示，TAP1上游CpG島甲基化程度與表達量成正相關(guān)，因此推測該CpG島可能對TAP1基因有激活作用。