1、豬鏈球菌病是一種重要的人獸共患傳染病，可以引起腦膜炎、敗血癥、心內(nèi)膜炎和關(guān)節(jié)炎等疾病。近年來由于抗生素濫用等原因，菌株對抗生素呈現(xiàn)嚴重耐藥和多重耐藥，給該病的防控帶來了困難。探索新的治療方法尤為迫切，其中基于噬菌體的治療策略再次引起關(guān)注。
　　噬菌體治療技術(shù)的關(guān)鍵在于細菌裂解作用，現(xiàn)有研究認為:噬菌體裂菌的生物化學基礎(chǔ)是其編碼的“穿孔素(holin)-裂解酶(lysin)”系統(tǒng)。而目前國內(nèi)外對豬鏈球菌噬菌體裂菌機制的研究較為鮮見。

2、為此在本實驗室前期研究的基礎(chǔ)上，進一步研究噬菌體穿孔素的亞細胞定位、膜拓撲結(jié)構(gòu)以及不同位點氨基酸對穿孔素定時裂菌功能的影響，研究結(jié)果對深入揭示基于穿孔素的裂菌機制具有重要意義。
　　為了確定穿孔素的亞細胞定位情況，選擇綠色熒光蛋白作為示蹤分子。首先把gfp基因插入到pET-32a(+)載體中，構(gòu)建質(zhì)粒p32G。然后利用DNA重組技術(shù)將gfp基因與holin基因的N-端通過不同長度的linker進行連接，獲得單一的融合基因表達載體p

3、32GH。將構(gòu)建的質(zhì)粒p32G和p32GH分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS細胞，陽性重組菌加入DiI染料培養(yǎng)，并經(jīng)IPTG誘導后采用共聚焦顯微鏡觀察。結(jié)果顯示只表達GFP的菌株，其綠色熒光彌散分布于整個細胞;而gfp與holin基因融合表達的菌株，綠色熒光則集中分布于細胞膜上。上述結(jié)果表明穿孔素holin定位于細菌細胞膜上。同時發(fā)現(xiàn)不同長度的linker對穿孔素的定時裂解功能影響很大。
　　為了揭示穿孔素holin的膜

4、拓撲結(jié)構(gòu)，采用半胱氨酸定點突變掃描技術(shù)(SCAM)解析了穿孔素上的關(guān)鍵氨基酸在膜內(nèi)外的分布情況。在綜合三種膜蛋白預測軟件解析結(jié)果的基礎(chǔ)上，在穿孔素不同的區(qū)域各選擇一個位點突變?yōu)榘腚装彼?，重組突變菌株用巰基試劑MPB進行原位標記，然后用辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素(Streptavidin-HRP)進行檢測。結(jié)果顯示這七個突變菌株，雖然只改變了一個氨基酸，但對其功能影響卻很大。通過分析這七個突變菌株，發(fā)現(xiàn)G35C、T80C、Y105C三

5、個位點分布在細胞膜內(nèi)，分別參與形成三個跨膜區(qū)，與基于生物學軟件預測的結(jié)果一致。
　　為了進一步研究基于穿孔素蛋白的裂菌機制以及每個跨膜區(qū)之間氨基酸的相互作用。在穿孔素蛋白編碼序列已知的基礎(chǔ)上，選擇不同位點的核苷酸進行突變，從而改變編碼的單個氨基酸，重組突變菌株與野生菌株相比僅改變了穿孔素上的一個氨基酸，經(jīng)誘導表達后測定其生長曲線，發(fā)現(xiàn)跨膜區(qū)的基因突變對穿孔素蛋白功能影響比較顯著。同一個氨基酸突變?yōu)椴煌陌被?，對生長曲線并沒有規(guī)律

6、性的影響。但不同位點的甲硫氨酸全部突變?yōu)榱涟彼?，生長曲線卻有顯著差異。而且，每個突變菌株與全長穿孔素重組菌pEXH1相比，裂菌時間均有變化，表明穿孔素蛋白的裂菌功能對其編碼序列十分敏感。
　　綜上可見，豬鏈球菌噬菌體的穿孔素holin定位于細胞膜;屬于Ⅰ型穿孔素蛋白，具有三個跨膜區(qū)，蛋白N-端和C-端均位于細胞膜外側(cè);穿孔素蛋白的功能對其編碼序列十分敏感，尤其是跨膜區(qū)序列。通過對穿孔素蛋白膜拓撲結(jié)構(gòu)的初步解析，將為深入揭示穿孔素觸