1、體細(xì)胞雜交技術(shù)不僅能夠克服有性生殖障礙，而且可以有效地同時轉(zhuǎn)移核基因與胞質(zhì)基因，促使優(yōu)良性狀在種內(nèi)、種間、屬間得到整合，從而獲得有性雜交無法得到的優(yōu)良種質(zhì)資源，豐富現(xiàn)有栽培種資源的遺傳背景。青枯病是茄科植物的重要的細(xì)菌性病害，其危害在馬鈴薯上僅次于晚疫病。目前我國馬鈴薯栽培品種缺少青枯病抗源，而存在于相關(guān)種中的優(yōu)良抗性資源由于有性雜交不親和又難以利用。因此，本研究旨在利用對稱及非對稱融合技術(shù)，將抗青枯病茄子優(yōu)良抗性基因染色體片段整合到馬

2、鈴薯栽培種中，創(chuàng)制抗青枯病馬鈴薯新資源。同時期望利用非對稱融合技術(shù)轉(zhuǎn)移馬鈴薯染色體片段到茄子中，建立馬鈴薯染色體片段導(dǎo)入系，為馬鈴薯遺傳基礎(chǔ)研究搭建新平臺。取得的主要研究結(jié)果如下:
　　1.親本原生質(zhì)體培養(yǎng)體系建立研究在對親本倍性確認(rèn)的基礎(chǔ)上，采用本實驗室建立的馬鈴薯原生質(zhì)體培養(yǎng)方法，選用7個馬鈴薯基因型進(jìn)行原生質(zhì)體培養(yǎng)研究。結(jié)果表明，不同基因型間培養(yǎng)反應(yīng)差異較大。前期液體淺層培養(yǎng)反應(yīng)較好的只有3個基因型，包括8＃、AC142、A

3、C239。后續(xù)培養(yǎng)中，分化培養(yǎng)只有AC142能再生植株。此外，馬鈴薯二倍體野生種S.chacoence(C9701)雖然前期培養(yǎng)生長緩慢，但在繼續(xù)培養(yǎng)中可以分化植株。
　　茄子E508來源于抗青枯病基因型“本地紅茄”的種子，組織培養(yǎng)下無性繁殖用于原生質(zhì)體培養(yǎng)體系建立。使用不同的預(yù)處理方法，培養(yǎng)基和激素組合，研究顯示，培養(yǎng)4周的試管苗，采用CM培養(yǎng)液黑暗預(yù)處理24h，適宜于茄子原生質(zhì)體分離;CM-Ⅰ為適于茄子原生質(zhì)體前期培養(yǎng)的培養(yǎng)基

4、;后續(xù)培養(yǎng)的適宜激素組合為1.0mg/L NAA+0.1mg/L 2,4-D+0.25mg/L ZT+0.25mg/L BA。
　　2.馬鈴薯-茄子對稱融合及其體細(xì)胞雜種鑒定研究以二倍體馬鈴薯AC142和茄子E508為融合親本，進(jìn)行原生質(zhì)體對稱融合，共獲得了117個再生植株。使用15對馬鈴薯SSR標(biāo)記引物和6對茄子SSR標(biāo)記引物，鑒定確認(rèn)了34個株系為體細(xì)胞雜種。流式細(xì)胞儀分析了17個體細(xì)胞雜種的倍性水平，結(jié)果顯示，17個被測雜種

5、株系中，3個系峰值與四倍體馬鈴薯種相似;8個系含有兩個二倍體馬鈴薯基因組和1個二倍體茄子基因組（六倍體）;另有6個非整倍體。對一個與馬鈴薯四倍體峰值相似的系PE29-1和一個按峰值推測含有四倍體馬鈴薯基因組和二倍體茄子基因組的雜種PE3-4，進(jìn)行染色體計數(shù)，結(jié)果證明PE3-4染色體數(shù)為72，PE29-1染色體數(shù)為48，與流式細(xì)胞儀測定結(jié)果相符。
　　3.對稱融合體細(xì)胞雜種染色體組成分別選取7個體細(xì)胞雜種（4個六倍體，1個四倍體和2

6、個非整倍體），采用基因組原位雜交(GISH)分析了其染色體組成。結(jié)果顯示，4個六倍體雜種均含有48條馬鈴薯染色體和24條茄子染色體。非整倍體的體細(xì)胞雜種PE60-10含54條馬鈴薯染色體，16條茄子染色體和7條重排染色體。對標(biāo)記檢測為雜種、倍性分析為四倍體的PE29-1進(jìn)行GISH分析，結(jié)果未檢測到茄子的雜交信號。上述結(jié)果表明，在馬鈴薯-茄子的融合中，即使是對稱融合，也很難獲得具有二倍體馬鈴薯和二倍體茄子染色體的雜種，二倍體馬鈴薯在體細(xì)

7、胞雜種中更容易加倍為為四倍體，這種加倍是兩個馬鈴薯細(xì)胞和一個茄子細(xì)胞融合產(chǎn)生、還是在培養(yǎng)過程中馬鈴薯染色體的加倍目前還不清楚。在非整倍體雜種中更容易發(fā)生染色體重排。
　　4.對稱雜種的胞質(zhì)組成研究采用在雙親間具有多態(tài)性的線粒體引物P4(pumD)分析了34個體細(xì)胞雜種的線粒體組成。結(jié)果顯示，除了PE29-4和PE57-4兩個株系只含有馬鈴薯親本帶以外，其它32個雜種株系線粒體均為雙親帶型，且在所有含有雙親帶型的雜種均出現(xiàn)了新帶型，

8、表明雙親線粒體基因組在融合后進(jìn)行了整合。選用兩個親本間具有多態(tài)性的葉綠體引物NTCP9和NTCP12，對體細(xì)胞雜種葉綠體基因組組成進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示34個體細(xì)胞雜種葉綠體擴(kuò)增帶型均與馬鈴薯親本一致。上述結(jié)果說明，在體細(xì)胞雜種中，線粒體更容易發(fā)生重組，而葉綠體則只能保留一個親本的基因組，且可能偏向遠(yuǎn)緣融合中提供核背景較多的親本一方。
　　5.對稱雜種的青枯病抗性評價本研究對11個生根正常的體細(xì)胞雜種初步進(jìn)行了青枯病抗性評價。使用青

9、枯菌1號生理小種對雜種株系試管苗進(jìn)行傷根接種，9個株系表現(xiàn)為抗青枯病，其中PE4-1的抗性顯著高于抗病茄子親本，其余8個系與之相當(dāng)。選擇試管苗接種后呈現(xiàn)抗性且缽栽生長正常的3個株系進(jìn)行室外接種，3個株系抗性水平與茄子親本相當(dāng)，表明馬鈴薯-茄子原生質(zhì)體融合成功地將茄子的青枯病抗性轉(zhuǎn)移到馬鈴薯中。
　　6.馬鈴薯-茄子非對稱融合及其融合子鑒定研究采用紫外線照射原生質(zhì)體破壞供體親本的染色體結(jié)構(gòu)，以利于融合中的染色體片段插入。
　　

10、以茄子E508為供體、馬鈴薯四倍體栽培種8＃為受體的非對稱融合中，共獲得73個再生株系。使用流式細(xì)胞儀對47個株系進(jìn)行倍性分析，結(jié)果表明，36個株系為四倍體，6個為混倍體，2個為非整倍體，1個為八倍體，還有2個株系在測定過程分別出現(xiàn)主峰數(shù)量減少和峰值改變的現(xiàn)象，說明在繼代過程中植株的染色體可能發(fā)生丟失。對16個非對稱融合再生株系形態(tài)特征進(jìn)行了觀察評價，它們均能結(jié)薯，但在薯形、葉片形態(tài)、長勢等性狀上具有不同程度的變異。這些變異是否因為茄子

11、的染色體片段插入而引起，還有待進(jìn)一步研究。
　　對馬鈴薯栽培種DH訥16為供體、茄子E508為受體的非對稱融合中，共獲得335個愈傷組織，到論文撰寫時獲得12個再生植株。由于大部分再生株系生根困難，生長緩慢，本研究只能對再生較早、能夠生根的3個株系進(jìn)行了鑒定分析。選用STI024、STI046和STM10883對在親本間具有有多態(tài)性的引物進(jìn)行分析，3個再生株系均含有馬鈴薯和茄子特異帶，表明它們?yōu)轶w細(xì)胞雜種。胞質(zhì)分析表明，雜種株系的