1、鴨圓環(huán)病毒(Duck circovirus，DuCV)主要是侵害宿主的免疫系統(tǒng)，而導(dǎo)致宿主免疫力低下，進(jìn)而引發(fā)二重或多重感染，可給養(yǎng)殖業(yè)造成極大經(jīng)濟(jì)損失。然而由于DuCV發(fā)現(xiàn)較晚，又缺乏體外培養(yǎng)DuCV的方法，因此對(duì)其致病機(jī)理及危害的研究尚存在很多困難。為了解DuCV在廣西鴨群中流行和變異，以及危害程度，明確廣西DuCV的基因型及優(yōu)勢(shì)基因型，并為創(chuàng)建研制DuCV抗體快速檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)。本研究擬從廣西DuCV遺傳變異分析及Cap蛋白的原

2、核表達(dá)兩個(gè)部分對(duì)廣西DuCV進(jìn)行研究和分析。
　　 1、廣西DuCV遺傳變異分析
　　 本研究采取PCR擴(kuò)增方法對(duì)2010～2012年間廣西9市鴨群中2569份內(nèi)臟組織樣品進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)出陽(yáng)性樣品194份，陽(yáng)性率為7.55％。其中，篩選部分陽(yáng)性樣品進(jìn)行基因組擴(kuò)增和比對(duì)分析，共獲得14個(gè)DuCV全基因組序列。基因組大小為1993nt、～1995nt，與已報(bào)道的其他DuCV毒株基因組大小一致。14個(gè)DuCV廣西毒株彼此之間

3、的同源性為93.5％～99.8％，與德國(guó)、美國(guó)、韓國(guó)分離株以及24個(gè)中國(guó)大陸毒株的同源性為92.2％～99.6％，而與另外18個(gè)大陸地區(qū)毒株和4個(gè)臺(tái)灣毒株同源性僅為82.3％～86.2％。
　　 DuCV基因組內(nèi)包含3個(gè)主要的開(kāi)放閱讀框(Open reading frame，ORF):ORFV1/rep、ORF C1/cap和ORF C2，所有14個(gè)廣西毒株在上述編碼區(qū)沒(méi)有核苷酸插入或者缺失現(xiàn)象。這14個(gè)廣西毒株Cap基因(OR

4、FC1)長(zhǎng)度均為774nt，編碼257個(gè)氨基酸。核苷酸序列同源性為89.5％～99.9％，氨基酸序列同源性為95.3％～100.0％。ORF C2長(zhǎng)度均為237nt，編碼78個(gè)氨基酸。核苷酸序列同源性為96.6％～100.0％，氨基酸序列同源性為91.1％～100.0％。Rep基因（ORF V1）長(zhǎng)度均為879nt，編碼292個(gè)氨基酸。核苷酸序列同源性為95.9％～99.7％，氨基酸序列同源性為98.3％～100.0％。
　　

5、基于DuCV基因組遺傳進(jìn)化樹(shù)分析顯示存在兩個(gè)明顯的分支即:基因1型與基因2型?；?型存在三個(gè)亞型即:基因1.1亞型、基因1.2亞型和基因1.3亞型。其中基因1.1亞型主要包括22個(gè)中國(guó)大陸毒株及一個(gè)德國(guó)毒株，基因1.2亞型則包括14個(gè)中國(guó)大陸毒株、一個(gè)美國(guó)毒株33753-52和4個(gè)韓國(guó)毒株，基因1.3亞型包括兩個(gè)中國(guó)大陸的毒株LJ07和LJ33。而基因2型也存在三個(gè)亞型即:基因2.1亞型、基因2.2亞型及基因2.3亞型。其中基因2.1

6、亞型包括中國(guó)臺(tái)灣的四個(gè)毒株，基因2.2亞型為15個(gè)中國(guó)大陸毒株，基因2.3亞型為三個(gè)中國(guó)大陸毒株MH02-07、MH11、HZ09。本研究所獲得的14個(gè)廣西毒株均屬于基因1型，其中QZ37-2012、QZ04-2011、LZ11-09、FC35-2012、QZ36-2012、TD41-09、FC33-2012、FC34-2012、FC32-2012、NN13-2012歸屬于基因1.1亞型，LZ01-2011、NN11-2012、NN12

7、-2012、PX08-2011歸屬于基因1.2亞型。
　　 2、DuCV Cap蛋白的原核表達(dá)
　　 使用Gene Designer2.0軟件（DNA2.0 inc公司）對(duì)Cap基因進(jìn)行分析和密碼子優(yōu)化，并在首尾分別加入BamHⅠ和SalⅠ位點(diǎn)，且去除基因內(nèi)部其余常見(jiàn)酶切位點(diǎn)。經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ酶切獲得了Cap基因片段，將其克隆至原核表達(dá)載體pET-32a(+)，構(gòu)建了DuCV Cap基因重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-

8、Cap。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)株感受態(tài)細(xì)胞，在終濃度為0.1 mmol/L的誘導(dǎo)劑IPTG中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，37℃250 r/min振搖培養(yǎng)誘導(dǎo)4h。SDS-PAGE電泳分析結(jié)果顯示Cap蛋白獲得成功表達(dá)，融合蛋白的分子質(zhì)量約為48 ku，表達(dá)的重組蛋白占菌體總蛋白的43.1％，主要以包涵體形式存在。Western Blot檢測(cè)顯示該融合蛋白可以被針對(duì)His標(biāo)簽蛋白的抗體所識(shí)別。利用鎳離子親和純化株進(jìn)行對(duì)重組蛋白進(jìn)行了純化，獲