1、近年來大多研究學者通過植物轉基因技術改良棉花性狀,已成功獲得了多種優(yōu)良品質的轉基因棉花。大多采用農桿菌介導法、基因槍法及花粉管道法,其中關于農桿菌介導的棉花遺傳轉化的研究頗多且研究機理較清楚。
　　農桿菌介導的棉花遺傳轉化體系通常以下胚軸為外植體,經歷組織培養(yǎng)的過程獲得再生植株。但該遺傳轉化體系通常受到基因型限制、轉化周期長、成胚率低等因素的限制。棉花莖尖分生組織具有發(fā)育成完整植株的能力,不受品種的限制及實驗周期短。本文在前人的工

2、作基礎上對棉花莖尖分生組織遺傳轉化體系進行改良。
　　目的:高速渦旋的玻璃粉創(chuàng)傷新陸早33成熟棉胚的莖尖分生組織,利用農桿菌介導法將gusA報告基因導入棉花,通過檢測評估該方法的轉化效率,探討不同的轉化條件(不同菌株、不同濃度、不同侵染方式、玻璃粉量及渦旋時間)對該方法遺傳轉化的影響。方法:棉花種子消毒后在無菌條件下用手剝離出棉胚,去除子葉后完全暴露出莖尖分生組織且不受損傷。2mLMS液體培養(yǎng)基、玻璃粉及棉胚轉至10mL離心管,3

3、000rpm高速渦旋創(chuàng)傷成熟棉胚后用農桿菌介導法侵染,設置了不同的單因素轉化條件:兩種菌種、三種菌液濃度、不同侵染方式、三種不同玻璃粉量及兩個渦旋時間。GUS組織化學染色部分棉胚及石蠟切片觀察棉胚轉化情況,余下棉胚篩選培養(yǎng)出幼苗,移栽后對幼苗葉片進行卡那霉素初步篩選、PCR檢測及GUS組織化學染色。
　　結果:農桿菌LBA4404與GV3101分別侵染棉胚,GUS染色發(fā)現農桿菌LBA4404轉化棉胚后較多細胞能被著色。GUS染色發(fā)

4、現菌液濃度OD600為0.8時棉胚的較多細胞被著色,能表達gusA的活性。采用不同的方法侵染棉胚,GUS染色發(fā)現方法1轉化棉胚后較多細胞能被著色。玻璃粉量越大對棉胚的損傷越嚴重,即插入棉胚的玻璃粉量越多,GUS染色發(fā)現0.2g玻璃粉轉化條件下棉胚及莖尖分生組織較多的細胞被染成藍色。隨著玻璃粉量加大,幼苗成活率降低,0.2g玻璃粉轉化條件下成活12株幼苗,比較適宜。渦旋時間越長對棉胚及莖尖分生組織損傷越嚴重,即插入棉胚的玻璃粉量越多,成苗

5、量下降,渦旋90s轉化條件下成苗量較低,但轉化效率有所提高,獲得2株GUS陽性苗。將染色后的棉胚石蠟切片后發(fā)現莖尖分生組織被染色且多層細胞能被著色。移栽成活78株幼苗,成活率為72.2％,用高濃度(200g/L)卡那霉素篩選幼苗葉片,篩選效果不明顯。PCR檢測到3株幼苗能擴出494bp條帶,GUS染色葉片后未被著色,為假陽性。結論:農桿菌LBA4404轉化效果較好;菌液濃度OD600為0.8時轉化效果較好;方法1的侵染效果較好。不同玻璃