1、對蝦白斑綜合癥病毒(White Spot Syndromic Virus，WSSV)，是一種嚴重危害對蝦養(yǎng)殖業(yè)的主要病原，目前還未找到有效的防治方法。
　　 小干擾RNA(siRNA)介導的RNA干擾是真核生物抵抗RNA病毒侵染的一種免疫機制，但動物是否可以利用siRNA途徑來抵抗DNA病毒的侵染，迄今還未見到相關報道。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)感染有雙鏈DNA病毒(WSSV)的日本對蝦可以產生具有抗病毒作用的siRNA(vp28-s

2、iRNA)。這一siRNA與WSSV的感染有著密切的聯(lián)系，它的產生和作用依賴于宿主的Dicer2和Ago2蛋白。利用熒光原位雜交技術，我們發(fā)現(xiàn)在vp28-siRNA存在于病毒感染48 h后的血淋巴細胞胞漿中。Dicer2的表達沉默導致了vp28-siRNA的表達缺失和病毒復制的加快。鎖核酸(LNA)修飾的反義核酸可以有效抑制vp28-siRNA的作用，導致病毒基因組拷貝數在病毒感染24-48 h后顯著上升。本研究首次表明了動物可以利用s

3、iRNA途徑來抵抗DNA病毒的侵染。
　　 MicroRNA(miRNA)是在轉錄后水平上調節(jié)基因表達的一種的非編碼小RNA，參與真核生物很多細胞過程。有報道表明病毒的侵染可以導致宿主miRNA的表達發(fā)生變化，但目前，對病毒感染相關海洋無脊椎動物miRNA的研究還未見報道。本論文以日本對蝦（Marsupenaeus japonicus）作為試驗材料，對WSSV感染不同時間段（0、6、24和48 h）的對蝦淋巴器官中的小RNA進行

4、高通量測序。我們共鑒定了63條對蝦miRNA，包括48條保守的miRNA（可歸為43個家族）和15條對蝦物種所特異的miRNA。其中，有31條miRNA在病毒感染后發(fā)生了顯著的差異表達，包括上調表達的25條和下調表達的6條。利用TargetScan和miRanda軟件，我們對差異表達的miRNA進行靶基因預測，并發(fā)現(xiàn)大多數靶基因與宿主的免疫反應有關。GO分析結果表明，這些差異表達的miRNA參與各種免疫信號途徑。通過進化分析，我們發(fā)現(xiàn)m

5、iR-1、miR-7和miR-34在對蝦、果蠅和人類中序列高度保守并參與相似的途徑。本研究首次對病毒感染相關的海洋無脊椎動物miRNA進行高通量測序和鑒定，揭示了miRNA在介導宿主和病毒間相互作用的分子機制。
　　 越來越多的哺乳動物細胞研究表明宿主miRNA在宿主抗病毒免疫中發(fā)揮著重要的作用，而有關無脊椎動物miRNA的抗病毒作用的研究目前還非常少。根據前面的結果，我們發(fā)現(xiàn)對蝦miR-7在WSSV感染過程中發(fā)生了顯著上調表達

6、，并可以靶向WSSV早期基因wsv477的3'非編碼區(qū)(3'UTR)，意味著宿主miR-7很可能參與病毒的DNA復制過程。在昆蟲High Five細胞中，我們驗證了體外合成的miR-7模擬物可以顯著降低攜帶有wsv4773'UTR的熒光質粒的表達。當miR-7模擬物的作用被鎖核酸修飾的anti-miR-7(AMO-miR-7)抑制后，熒光質粒的表達又恢復到正常水平。體內試驗結果表明，miR-7的過表達可以導致WSSV基因組拷貝數在病毒感

7、染72 h和96h后下降到對照組(只注射WSSV)的1/1000。相反地，AMO-miR-7抑制內源性miR-7后，WSSV基因組拷貝數較對照組上升了一個數量級。研究還發(fā)現(xiàn)，miR-7的產生依賴于Dicer1蛋白。因此，本研究揭示了無脊椎動物miRNA及其病毒靶基因在宿主和病毒間存在著相互作用。
　　 近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，動物DNA病毒在侵染宿主過程中也可以編碼自身的miRNA。然而，有關病毒miRNA的作用機制目前還不是

8、很清楚，尤其是無脊椎動物DNA病毒產生的miRNA。本研究對WSSV感染0、6、24和48 h后的對蝦淋巴器官的小RNA文庫中進行深入分析，共鑒定了49條WSSV編碼的miRNA。利用Vmir軟件預測和miRNA芯片雜交技術，我們從WSSV感染24和48h后的對蝦淋巴器官、血淋巴細胞和腮組織中再鑒定了151條WSSV miRNA。miRNA芯片雜交結果表明，WSSV miRNA的表達具有組織特異性和時序特異性。利用生物信息學方法，我們對

9、測序獲得的49條WSSV miRNA進行靶基因預測和GO分析。通過進一步研究發(fā)現(xiàn)，WSSV可以利用自身編碼的WSSV-miR-24抑制宿主血淋巴細胞的凋亡反應。體外和體內分析表明，WSSV-miR-24可以通過靶向宿主Caspase8基因的3'UTR抑制該基因的表達，從而降低了宿主細胞的凋亡水平和Caspase酶活，促進了WSSV在血淋巴細胞中的存活和復制。本研究綜合了小RNA高通量測序、miRNA芯片雜交和生物信息學預測等方法，對WS

10、SV編碼的miRNA進行深入挖掘，并首次揭示了無脊椎動物病毒可以利用自身編碼miRNA對宿主先天性免疫系統(tǒng)進行干預。
　　 Argonaute(Ago)蛋白是siRNA和miRNA通路中的關鍵蛋白，在宿主RNAi抗病毒免疫中發(fā)揮著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)許多真核生物擁有多個Ago蛋白和異構體，而有關Ago異構體的功能仍知之甚少。本研究發(fā)現(xiàn)日本對蝦Ago1基因產生三種不同轉錄本，分別是Ago1A、Ago1B和Ago1C，其中Ago1

11、A和Ago1B在PIWI結構域中包含有一段72bp的插入序列。通過熒光定量PCR，我們發(fā)現(xiàn)Ago1A和Ago1B在對蝦淋巴器官和血淋巴細胞中有較高的表達水平并在WSSV感染后發(fā)生了顯著上調表達，說明了這兩個Ago1異構體與對蝦抗病毒有關。研究發(fā)現(xiàn):Ago1A的表達沉默可以導致病毒基因組拷貝數顯著增加。當Ago1BmRNA被特異性siRNA敲低到30-63％水平后，WSSV基因組拷貝數較對照組(只注射WSSV)發(fā)生了顯著的增加;而進一步敲

12、低Ago1BmRNA至15％以下，WSSV拷貝數較對照組不僅沒有顯著性增加，反而促進Ago1AmRNA的上調表達?？赡苁茿go1A的上調表達彌補了Ago1B在宿主抗病毒中的缺失，導致了Ago1B表達沉默后對病毒復制沒有明顯的影響。與單獨抑制Ago1A或Ago1B相比，同時抑制Ago1 A和Ago1B的表達導致了宿主對病毒的侵染產生更強的敏感性，而抑制Ago1C對病毒的復制沒有任何影響，說明了Ago1A和Ago1B在對蝦抵抗WSSV侵染中

13、發(fā)揮著關鍵作用。因此，本研究首次在無脊椎動物中揭示了Ago異構體的產生與抗病毒有關。
　　 RNaseⅢ家族成員Drosha是miRNA成熟過程中的第一個關鍵蛋白，但迄今為止對Drosha蛋白在病毒感染中的作用機制仍不清楚。本研究首次克隆了日本對蝦的Drosha基因，并通過序列分析發(fā)現(xiàn)該基因可以編碼1081個氨基酸殘基的多肽。對蝦Drosha蛋白包含了兩個RNaseⅢ結構域和雙鏈RNA結合結構域，與其他物種的Drosha蛋白具有

14、較高的同源性。熒光定量PCR結果表明:Drosha基因在對蝦淋巴器官中具有較高的表達水平，并在WSSV刺激后發(fā)生了顯著的上調表達，說明了該蛋白與對蝦的抗病毒有關。Drosha基因的表達沉默不僅影響了miRNA的成熟，還導致宿主對病毒的敏感性增強，說明了Drosha在對蝦抵抗病毒侵染中發(fā)揮著重要的作用。
　　 RNA干擾在真核生物抵抗RNA病毒侵染中發(fā)揮著重要的作用，然而這種保守的抗病毒機制是否也是無脊椎動物抵抗DNA病毒侵染的一