1、電壓依賴性陰離子通道(voltage-dependentanionchannel,VDAC)蛋白,廣泛存在于從真菌到動(dòng)植物的生物體中,依賴電壓調(diào)節(jié)其對(duì)陰陽離子的選擇性。研究表明,VDAC是由一個(gè)小的基因家族編碼,除了在線粒體外膜上存在外,在其它細(xì)胞組分中也存在具有VDAC結(jié)構(gòu)的蛋白。植物通常比哺乳動(dòng)物具有更多的VDAC異構(gòu)體。
　　本實(shí)驗(yàn)室前期通過生物信息學(xué)及表達(dá)分析,證實(shí)在水稻基因組中有8個(gè)vdac功能基因。和哺乳動(dòng)物的3個(gè)vd

2、ac基因相比,水稻的8個(gè)vdac基因所編碼的蛋白的亞細(xì)胞定位、高級(jí)結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能尚不清楚。
　　本研究選取兩個(gè)在水稻花粉發(fā)育時(shí)期表達(dá)量較高的基因osvdac3和osvdac5,以及另外兩個(gè)vdac基因osvdac1和osvdac4為研究對(duì)象,對(duì)其進(jìn)行了亞細(xì)胞定位的初步研究,并對(duì)過表達(dá)osvdac3的水稻植株的生長(zhǎng)進(jìn)行了初步研究。主要結(jié)果如下:
　　1、根據(jù)osvdac3和osvdac5基因的ORF設(shè)計(jì)特異引物,將其分別克隆

3、到植物表達(dá)載體pCAMBIA1302-rfp,構(gòu)建了CaMV35S∷osvdac3∷rfp和CaMV35S∷osvdac5∷rfp過表達(dá)載體,以水稻YTB為受體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。結(jié)果表明,只有用CaMV35S∷osvdac3∷rfp的遺傳轉(zhuǎn)化獲得到了陽性轉(zhuǎn)基因植株。RT-PCR結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因陽性植株中osvdac3基因表達(dá)量較野生型YTB及轉(zhuǎn)基因陰性植株均有不同程度的提高。表型觀察發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因T0代陽性植株比陰性植株及野生型植株株高下降,

4、花粉育性也有不同程度的降低;對(duì)osvdac3基因超表達(dá)陽性家系T1代植株用NaCl和Mannitol協(xié)迫處理,其超表達(dá)陽性家系植株較陰性家系及野生型YTB植株的株高低、根長(zhǎng)短。
　　2、根據(jù)osvdac1、osvdac3、osvdac4和osvdac5基因的ORF及osvdac3、osvdac5基因的C端和N端序列設(shè)計(jì)特異引物,擴(kuò)增片段克隆到原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)載體pM999-gfp中,將其轉(zhuǎn)染水稻黃化苗提取的原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá),并進(jìn)行

5、GFP和細(xì)胞器染料共定位分析。結(jié)果表明,OsVDAC1蛋白定位于細(xì)胞質(zhì);OsVDAC4蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)及線粒體;OsVDAC3蛋白定位于除細(xì)胞核及線粒體外的細(xì)胞器。而OsVDAC3-C端、N端蛋白的定位結(jié)果表明,其也位于細(xì)胞質(zhì)及質(zhì)膜;OsVDAC5蛋白分布在細(xì)胞核的周圍,其綠色熒光的形狀有一定的折疊,與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的構(gòu)象比較一致,推測(cè)其可能定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),而OsVDAC5-N端則位于細(xì)胞質(zhì)及質(zhì)膜。
　　3、利用實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的pET-30a