1、雞馬立克氏病(Marek's disease，MD)是由馬立克氏病毒(Marek's disease virus，MDV)引起的一種雞的惡性淋巴腫瘤疾病，是雞的三大腫瘤病之一。目前乃至將來相當長的一段時間里它在養(yǎng)雞業(yè)中都具有重要的經(jīng)濟意義。錯配修復基因(mismathrepair gene，MMR)是細胞內(nèi)負責對堿基錯配進行修復的基因，它們的缺陷會導致腫瘤相關基因的突變不能被及時有效糾正，從而使得宿主易感腫瘤。此類基因中MLH1和MSH

2、2占主要地位，它們的功能是在生理狀況下可以表達豐富的蛋白產(chǎn)物來維持基因的穩(wěn)定性，當其發(fā)生突變、缺失或其他改變時，會影響其正常表達，出現(xiàn)錯配修復功能障礙，其表現(xiàn)為不能對宿主DNA的堿基的轉(zhuǎn)換和顛換突變進行識別和修復，因而使某些抑癌基因失活或一些腫瘤基因被激活，最終導致宿主細胞凋亡或腫瘤形成。本試驗是對健康雞的MMRMLH1基因以及對患MD雞的腫瘤組織中的MLH1基因突變情況和蛋白表達情況進行研究。旨在探索雞的MLH1基因與MD腫瘤發(fā)生的關

3、系。
　　 試驗分兩大部分，第一部分是檢測了MLH1基因的19對外顯子基因突變情況，具體操作是先通過HE染色確定患雞的腫瘤組織和正常組織，再分別從中提取DNA，以NCBI上公布的MLH1基因DNA序列的19對外顯子序列來設計引物，進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，確定為目的條帶后，通過PCR-SSCP技術來檢測MD同一只雞的肌肉組織和內(nèi)臟組織間有無條帶的差異，來推測MLH1基因是否存在基因突變。結(jié)合SSCP和病理切片

4、結(jié)果，提取病灶明顯的同一只雞的腫瘤組織和健康組織的DNA，并以其為模板，MLH1基因的19對外顯子引物，進行PCR擴增，經(jīng)驗證條帶單一后，擴大PCR體系并將產(chǎn)物純化后測序分析。用DNAstar軟件對正常組織和腫瘤組織的DNA序列測序結(jié)果進行比對，尋找確定是否存在核酸層次的改變（堿基改變、插入、缺失等）和氨基酸層次的改變，判定MLH1基因有無基因突變。第二部分用免疫組化染色方法檢測MLH1基因在MD腫瘤組織中的蛋白表達情況，鑒別腫瘤細胞的

5、類型。具體做法是將福爾馬林固定的腫瘤組織做常規(guī)的石蠟切片，分別進行（蘇木精伊紅）HE和免疫組化（常規(guī)IHC和T/B淋巴細胞）染色，檢測腫瘤病灶和灶旁組織的MLH1基因表達情況。
　　 試驗結(jié)果為通過PCR-SSCP檢測，未檢測到有條帶的差異，即未檢測到MLH1有基因突變。通過HE染色發(fā)現(xiàn)2號雞的肝臟組織呈現(xiàn)結(jié)節(jié)性病灶，對其提取DNA并進行測序，經(jīng)過軟件DNA star比對后，肝臟腫瘤和健康組織的DNA序列未發(fā)現(xiàn)有差異，即從核酸層