1、土拉霉素作為新一代大環(huán)內(nèi)酯類動(dòng)物專用抗生素具有藥效持久，消除半衰期長(zhǎng)等眾多優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)土拉霉素在牛和豬可食性組織中殘留對(duì)食品安全和人體健康可能帶來(lái)不利影響也值得關(guān)注。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)土拉霉素殘留的微生物安全性評(píng)價(jià)尚有不足之處，EMEA，F(xiàn)DA和APVMA關(guān)于其微生物學(xué)NOAEL/NOAEC的確定僅局限于短期的體外藥敏試驗(yàn)中對(duì)腸道菌MIC50的測(cè)定，缺乏土拉霉素長(zhǎng)期作用于人體腸道菌可能帶來(lái)不利影響的資料，如腸道菌群數(shù)量與結(jié)構(gòu)、菌群代謝，定植屏障

2、功能和耐藥性變化等指標(biāo)。作為新獸藥一些潛在的毒副作用尚未充分體現(xiàn)出來(lái)，因此有必要進(jìn)行土拉霉素殘留對(duì)人腸道菌群影響的系統(tǒng)全面的研究，從而為制定更合理的ADI提供參考數(shù)據(jù)。同時(shí)在藥物長(zhǎng)期選擇壓力下，人腸道條件致病菌的耐藥性和毒力特性可能發(fā)生變化，對(duì)人體健康存在潛在的致病性和危害性，本研究選擇糞腸球菌為目標(biāo)菌，闡釋細(xì)菌耐藥、毒力的變化和聯(lián)系，以及細(xì)菌致病能力的變化。
　　 1土拉霉素對(duì)人腸道菌兩個(gè)微生物學(xué)端點(diǎn)的影響
　　 本研

3、究采用體外連續(xù)培養(yǎng)的恒化模型來(lái)評(píng)估土拉霉素對(duì)人腸道菌群的影響，根據(jù)官方報(bào)告中土拉霉素對(duì)腸道菌MIC50值(EMEA，1.5μg/mL;APVMA，1μg/mL)和體外預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果最終確定模型中土拉霉素的添加濃度分別為0，0.1，1，10和100μg/mL共5個(gè)濃度。對(duì)給藥前后兩個(gè)重要的微生物學(xué)端點(diǎn)定植屏障功能和耐藥性的變化進(jìn)行考察，定植屏障功能變化包括三個(gè)指標(biāo)，四種優(yōu)勢(shì)菌數(shù)量變化，代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸的變化和致病菌沙門氏菌的定植。
　

4、　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果為，在低劑量組(0.1和1μg/mL)，腸道菌群的定植屏障功能和耐藥性各指標(biāo)均處于95％置信區(qū)間內(nèi)，對(duì)腸道菌群無(wú)顯著性影響。中濃度組(10μg/mL)，腸球菌和脆弱擬桿菌的數(shù)量分別第18和16d后呈現(xiàn)顯著性降低，細(xì)菌數(shù)量比95％置信下限分別降低了大約1.6和6倍，其他細(xì)菌數(shù)量在正常范圍內(nèi)，短鏈脂肪酸中只有丙酸含量稍低于95％置信下限，未見鼠傷寒沙門氏菌的定植，腸球菌和脆弱擬桿菌的耐藥率呈現(xiàn)輕微上升的波動(dòng)，說(shuō)明此濃度下對(duì)腸道

5、菌群屏障功能和耐藥性產(chǎn)生了輕微的影響。高濃度組(100μg/mL)大腸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量較95％置信下限降低了6倍左右，脆弱擬桿菌數(shù)量降低了近100倍，腸球菌的數(shù)量卻呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，短鏈脂肪酸乙酸，丙酸和丁酸的濃度分別降低了大約1.3，1.3和2.7倍，侵襲菌鼠傷寒沙門氏菌細(xì)菌數(shù)量維持在105-106CFU/mL，實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定生長(zhǎng)，以上均說(shuō)明在了高濃度組腸道菌群的屏障功能受到顯著性影響，造成了菌群紊亂和失調(diào)。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道，推測(cè)

6、腸道菌群的定植屏障功能可能與腸桿菌科的數(shù)量變化密切相關(guān)。同時(shí)，在藥物作用下大腸桿菌，腸球菌和雙歧桿菌的耐藥率均呈現(xiàn)顯著性提高，腸球菌和雙歧桿菌的耐藥率甚至達(dá)到了80％，土拉霉素對(duì)腸道菌群耐藥性的影響比其對(duì)定植屏障功能影響更加明顯。
　　 在1μg/mL下，腸道菌群耐藥性和屏障功能均未發(fā)生顯著性變化，因此其對(duì)人腸道菌群的最大無(wú)明顯副作用濃度(NOAEC)為1μg/mL，根據(jù)VICH的ADI計(jì)算公式得到其對(duì)人腸道菌群影響的微生物學(xué)A

7、DI值為4.58μg/kg.bw/day(0.27mg/person/day)，低于FDA(50μg/kg.bw/day)，EMEA(10.97μg/kg.bw/day)和APVMA(5μg/kg.bw/day)已經(jīng)制定的微生物學(xué)ADI值。
　　 2土拉霉素對(duì)糞腸球菌耐藥性和毒性的影響
　　 對(duì)藥物作用前后糞腸球菌進(jìn)行分離鑒定，測(cè)定藥物作用前后糞腸球菌耐藥表型、基因型和耐藥轉(zhuǎn)移能力的變化，同時(shí)，對(duì)腸球菌中五種毒力因子表面

8、蛋白esp，細(xì)胞溶血素cylA，明膠酶gelE，膠原結(jié)合蛋白ace和聚集蛋白asal進(jìn)行測(cè)定，考察細(xì)菌毒性變化和對(duì)小鼠的致病能力，并且分析細(xì)菌耐藥性和毒性的關(guān)系。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果為，在土拉霉素作用前后，糞腸球菌對(duì)土拉霉素的MIC50值由4.904升高到244.149，提高了49.8倍，同時(shí)對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類、林可胺類和鏈陽(yáng)菌素B菌呈現(xiàn)高水平交叉耐藥，耐藥表型為典型的MLSB，且主要是由ermB基因介導(dǎo)相關(guān)(陽(yáng)性率達(dá)到88.46％)，而

9、ermB基因基本上全部位于轉(zhuǎn)座子Tn1545內(nèi)，腸道菌耐藥性的顯著性提高，很可能與轉(zhuǎn)座子Tn1545介導(dǎo)的ermB基因的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
　　 藥物作用后，糞腸球菌中一些毒力因子的表達(dá)也呈現(xiàn)明顯的變化，毒力因子esp和cylA的檢出率顯著性提高（由0升至70％），gelE的檢出率卻呈現(xiàn)顯著減低（由61.76％降至20％），同時(shí)ermB與esp，cylA之間存在明顯的正相關(guān)關(guān)系，與gelE基因間存在著明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系。推測(cè)在轉(zhuǎn)座子T

10、n1545的附屬基因區(qū)內(nèi)可能同時(shí)含有耐藥基因ermB和毒力因子esp、cylA、gelE，受到相同調(diào)控區(qū)基因的調(diào)控，糞腸球菌利用可接合復(fù)合型轉(zhuǎn)座子Tn1545實(shí)現(xiàn)耐藥基因和毒力因子的積累。
　　 含有毒力因子esp，cylA的耐藥糞腸球菌的毒性強(qiáng)于毒力因子陰性的菌株，腹腔攻毒后前者造成小鼠急性死亡死的時(shí)間集中在8h內(nèi)，后者造成小鼠的死亡時(shí)間相對(duì)延后，主要集中24h以內(nèi)，半數(shù)致死量LD50后者是前者的3.8倍，細(xì)菌在小鼠體內(nèi)廣泛分