1、稻飛虱（半翅目:飛虱科）是我國和其他許多亞洲國家當(dāng)前水稻上的重要害蟲。其中最為重要的三種稻飛虱優(yōu)勢種是褐飛虱、白背飛虱和灰飛虱。除了直接刺吸危害水稻以外，它們還能傳播病毒病害，對水稻的產(chǎn)量造成嚴(yán)重的損失。由于其短時間內(nèi)即可暴發(fā)成災(zāi)的特性，當(dāng)前對稻飛虱的防治方法仍然以傳統(tǒng)的化學(xué)防治為主。長期的農(nóng)藥使用不僅造成了稻飛虱的抗藥性問題，也引起了環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留等問題。因此，尋找更為有效且環(huán)境友好的治理稻飛虱問題的方法就顯得尤為重要。胞內(nèi)共生菌

2、Wolbachia和Cardinium作為一類生防因子，有著很好的生防應(yīng)用潛力。
　　本文通過系統(tǒng)的調(diào)查，揭示了Wolbachia和Cardinium在褐飛虱、白背飛虱和灰飛虱自然種群中的感染情況?；诙辔稽c序列分型技術(shù)和基因重組分析，明確地鑒定了這三種稻飛虱及其相關(guān)物種中感染的Wolbachia株系類型，揭示了它們之間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系和遺傳變異的方式，并探討了稻飛虱中這兩類寄生菌的來源。通過對三種飛虱線粒體基因組的研究，深入分析了

3、胞內(nèi)共生菌Wolbachia與稻飛虱之間的進(jìn)化關(guān)系。同時，通過對稻飛虱中誘導(dǎo)胞質(zhì)不親和(cytoplasmicincompatibility，CI)的wStri株系和不誘導(dǎo)CI作用的wLug株系的基因組測序，深入地比較了已有Wolbachia基因組之間的差異性。這些研究工作為進(jìn)一步揭示誘導(dǎo)CI的分子機(jī)理和利用胞內(nèi)共生菌治理稻飛虱的研究奠定了良好的工作基礎(chǔ)。
　　1.Wolbachia和Cardinium在中國稻飛虱優(yōu)勢種中的感染情

4、況
　　研究結(jié)果表明，分布于全國各個稻區(qū)的三種主要稻飛虱對Wolbachia和Cardinium的感染情況有著明顯的差異。其中灰飛虱的感染率最高（幾乎為100％），其次為白背飛虱，褐飛虱的感染率最低。在檢測的15個灰飛虱地理種群中，有14個種群都是100％感染，只有一個西北種群（甘肅靖遠(yuǎn)）種群完全不感染W(wǎng)olbachia。對于白背飛虱，雌雄蟲中Wolbachia的感染情況有著明顯的差別。雌蟲幾乎都是100％感染，而各個種群中的雄蟲

5、感染率卻不盡相同，從22.2％～95.0％不等。進(jìn)一步對Wolbachia宿主特異性WO噬菌體的檢測結(jié)果表明，自然種群雄蟲中Wolbachia的感染率與在不感染個體中檢測到的WO噬菌體的比率呈明顯的負(fù)相關(guān)。因此推測，雄蟲中Wolbachia感染率相對較低的原因可能是由于Wolbachia基因組中溶原性的WO噬菌體受到某種因素的誘導(dǎo)已轉(zhuǎn)化為裂解性噬菌體，并且這種誘發(fā)機(jī)制與寄主的性別存在著一定的相關(guān)性。對于另一類胞內(nèi)寄生菌Cardinium

6、，在三種稻飛虱中只有白背飛虱雙重感染了Wolbachia和Cardinium，并且白背飛虱各種群Cardinium的感染率幾乎均為100％。對飛白背虱的不同組織部位檢測結(jié)果表明，與褐飛虱、灰飛虱相似，Wolbachia和Cardinium這兩類胞內(nèi)共生菌不僅在白背飛虱的生殖組織中感染，在非生殖組織（頭部、胸部、足和翅）中同樣感染。研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示W(wǎng)olbachia和Cardinium雙重感染條件下對寄主的生殖調(diào)控作用及其機(jī)制、垂直傳

7、播規(guī)律、兩者之間的相互關(guān)系以及進(jìn)一步的應(yīng)用研究等方面提供了重要的理論基礎(chǔ)。
　　2.Wolbachia的系統(tǒng)發(fā)育研究和稻飛虱中胞內(nèi)共生菌的來源推測
　　運用多位點序列分型技術(shù)（MultilocusSequenceTyping，MLST）對不同寄主中的Wolbachia株系鑒定結(jié)果表明，灰飛虱與白背飛虱感染了同一個Wolbachia株系（wStri）;褐飛虱感染了另一個Wolbachia株系(wLug)且與其近緣種偽褐飛虱中發(fā)

8、現(xiàn)的Wolbachia株系（命名為wMui）的親緣關(guān)系并不是最近緣的。這些Wolbachia株系與寄主之間沒有明顯的共進(jìn)化現(xiàn)象。另外，在一種葉蟬中也檢測到了三種Wolbachia株系（不確定其真實寄主，暫命名為wMfasl、wMfas2、wMfas3）。限制性酶切片段長度多態(tài)性（RFLP）實驗和直接測序結(jié)果表明，與灰飛虱、白背飛虱一樣，在褐飛虱自然種群個體中同樣存在感染了Wolbachia的內(nèi)寄生物。經(jīng)MLST驗證表明，這些可能源自于稻

9、飛虱內(nèi)寄生物的Wolbachia株系中，除了wWasp株系以外，還發(fā)現(xiàn)有wStri株系。稻飛虱與其寄生物感染相同株系的Wolbachia和Cardinium，表明了三種飛虱中這兩類寄生菌很可能都是通過水平傳播獲得的。同源基因重組檢測結(jié)果表明，不同Wolbachia株系之間存在著基因重組現(xiàn)象，并且在飛虱感染的Wolbachia株系與稻田生態(tài)系統(tǒng)中與飛虱有一定相關(guān)性的其他物種中感染的Wolbachia之間存在著廣泛的wsp基因重組現(xiàn)象。這些

10、研究結(jié)果有助于我們理解稻飛虱中Wolbachia的遺傳變異方式。
　　3.稻飛虱中Wolbachia的人工轉(zhuǎn)染研究初探
　　前期的研究結(jié)果表明，褐飛虱體內(nèi)感染的Wolbachia株系不能誘導(dǎo)寄主的細(xì)胞質(zhì)不親和現(xiàn)象，而灰飛虱和白背飛虱中感染的Wolbachia能誘導(dǎo)較強的CI作用。并且前文的研究結(jié)果表明，自然種群中褐飛虱、灰飛虱感染的Wolbachia之間似乎并不能相互水平傳染。這是因為沒有水平傳播的媒介？還是由于寄主本身的遺

11、傳差異性引起的？為了揭示不同Wolbachia株系與稻飛虱的相互關(guān)系以及探索Wolbachia等胞內(nèi)共生菌在稻飛虱生防應(yīng)用中的潛力，本文以不感染的稻飛虱為研究材料，采用顯微注射的方法對不同稻飛虱進(jìn)行了不同Wolbachia株系的人工轉(zhuǎn)染研究。結(jié)果表明，在實驗室條件下，褐飛虱、灰飛虱中感染的Wolbachia株系在這兩種飛虱之間相互轉(zhuǎn)染較難實現(xiàn)。進(jìn)一步將煙粉虱以及葉螨中感染的Wolbachia株系注射到褐飛虱中的研究表明，這些物種中的Wo

12、lbachia株系也不能在褐飛虱中成功的定殖。這些研究結(jié)果表明，褐飛虱、灰飛虱中感染的Wolbachia株系在兩種飛虱間不能相互轉(zhuǎn)染的主要原因可能并不是沒有合適的水平傳播媒介，而是更多的與兩種飛虱的遺傳背景差異有關(guān)，很可能是跟寄主的免疫有關(guān)。
　　4.胞內(nèi)共生菌與三種稻飛虱的進(jìn)化關(guān)系研究
　　以三種飛虱的線粒體基因組以及灰飛虱線粒體多樣性研究做為切入點，進(jìn)一步探討了稻飛虱與其胞內(nèi)共生菌之間的進(jìn)化關(guān)系。研究結(jié)果表明:1.三種稻

13、飛虱的線粒體基因組有著許多共同的特征，比如:線粒體基因的重排方式、控制區(qū)長度多態(tài)性（含有可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列VNTRs，variablenumberoftandemrepeats）、不正常的atp8基因長度等。這些特征表明了三種飛虱有著共同的祖先特征。2.三種飛虱中，灰飛虱與白背飛虱之間相對更近的進(jìn)化關(guān)系也有著許多線粒體基因組特征的支撐，比如:兩者線粒體控制區(qū)中的重復(fù)區(qū)有著完全一樣的重復(fù)單元（且與褐飛虱中的重復(fù)單元序列相似），蛋白編碼基

14、因有著更為相似的基因長度，trnS2有著類似的二級結(jié)構(gòu)等等。3.利用線粒體基因組蛋白編碼基因同義替換率推測:白背飛虱與灰飛虱大概是在80.3～87.6百萬年前發(fā)生的分化;褐飛虱的分化更早一點，大概發(fā)生在87.3～95.2百萬年前。而wStri與wLug兩個株系之間的分化時間大約在12.4-14.1百萬年左右。通過物種分化形成時間的對比，揭示了三種稻飛虱中感染的Wolbachia是在稻飛虱進(jìn)化后期通過感染獲得的，而不是早先存在于三種飛虱的

15、祖先種中并隨之進(jìn)化而來的。4.有研究表明，灰飛虱感染的Wolbachia株系wStri對寄主有著極強的誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)不親和的能力。因此，wStri自侵染灰飛虱后理論上會導(dǎo)致灰飛虱線粒體多樣性的降低?；绎w虱線粒體單倍型的研究表明，雖然灰飛虱自然種群個體間的分化程度較?。ㄐ蛄袉伪缎椭g的差異小于1％），但是單倍型之間仍然存在的一定程度的分化。這說明了灰飛虱中wStri株系的感染已經(jīng)有了一定的歷史時間。對比白背飛虱自然個體線粒體的分化程度，本研究

16、認(rèn)為雖然稻飛虱感染W(wǎng)olbachia在稻飛虱物種進(jìn)化過程中的歷史相對較短，但是在兩種飛虱中Wolbachia的感染時間可能仍存在差異性（wStri株系感染灰飛虱的歷史可能要比感染白背飛虱的歷史更久遠(yuǎn)一些）。
　　5.稻飛虱中Wolbachia的比較基因組學(xué)研究
　　Wolbachia對寄主的生殖調(diào)控機(jī)理一直以來都是胞內(nèi)共生菌研究的熱點和難點。三種飛虱中感染的兩個Wolbachia株系一個誘導(dǎo)CI（灰飛虱和白背感染的wStri

17、株系）作用，另外一個不誘導(dǎo)CI（褐飛虱感染的wLug株系），系統(tǒng)發(fā)育研究表明這兩者的親緣關(guān)系又比較近，因此是研究Wolbachia誘導(dǎo)CI分子機(jī)理很好的比較基因組學(xué)研究材料。同時，現(xiàn)有的已完成基因組測序的Wolbachia株系中還沒有不誘導(dǎo)CI的Wolbachia株系，開展本研究中兩種不同生殖調(diào)控表型的Wolbachia基因組學(xué)的研究有利于我們更進(jìn)一步的揭示W(wǎng)olbachia誘導(dǎo)CI的分子機(jī)理。以這兩個Wolbachia株系的全基因組測

18、序為研究切入點，本文從比較基因組學(xué)的角度對誘導(dǎo)CI的分子機(jī)理做了初步的探索研究。研究結(jié)果表明:本文中所測的兩個Wolbachia株系是目前研究發(fā)現(xiàn)最大的Wolbachia基因組，分別含有1771(wStri)和1589(wLug)個基因，并且都包含了四型分泌系統(tǒng)（ThetypeⅣsecretionsystem，T4SS）相關(guān)的基因。2.通過與已知Wolbachia株系基因組的比較，揭示了不同Wolbachia大組之間的差異性。3.兩個W