1、龍眼是福建重要的亞熱帶特色水果。然而，人們對龍眼的遺傳背景了解甚少，生產(chǎn)上存在的品種老化、良莠不一等突出問題，嚴(yán)重限制了龍眼的資源開發(fā)利用和生產(chǎn)的發(fā)展。前人應(yīng)用同工酶、RAPD分析等標(biāo)記對小樣本的龍眼遺傳資源進(jìn)行了初步研究，而在整個(gè)有代表性的遺傳資源的分析卻未見報(bào)道。因此有必要應(yīng)用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合POD同工酶分析技術(shù)對龍眼的遺傳資源進(jìn)行較為全面的遺傳資源分析。本研究優(yōu)化了龍眼POD同工酶提取和電泳體系；摸索出適合龍眼葉片基因組D

2、NA的提取方法；建立和優(yōu)化了龍眼RAPD反應(yīng)體系；采用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)，輔以POD同工酶分析，結(jié)合聚類分析，對以福建龍眼遺傳資源為主的95份國內(nèi)外龍眼遺傳資源，進(jìn)行了遺傳資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析。主要研究結(jié)果如下： 一、龍眼POD同工酶提取和電泳體系的優(yōu)化。針對POD同工酶酶的活性和酶帶數(shù)受到材料新鮮度、提取液的成分、電泳和染色方法的影響，經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)，改進(jìn)確立了龍眼POD同工酶提取和電泳的優(yōu)化體系，首次確定供試材料以

3、葉齡為3～6月齡的龍眼葉片為佳，以低濃度的磷酸緩沖液(0.05mol/LpH7.5的PBS加0.1％的Triton)為宜。同工酶電泳采取聚丙烯酰胺凝膠電泳法，染色方法采用醋酸-聯(lián)苯胺染色法。改進(jìn)優(yōu)化的龍眼POD同工酶提取和電泳的體系，使以往只能獲得的POD同工酶酶譜從8條增加到17條。 二、龍眼遺傳資源親緣關(guān)系的POD同工酶分析。整個(gè)酶譜共產(chǎn)生17條酶帶劃分為4大酶區(qū)。其中第Ⅰ酶區(qū)和第Ⅲ酶區(qū)是龍眼POD的活性區(qū)，在這兩個(gè)區(qū)域的酶

4、帶比較固定，且活性大。第Ⅱ酶區(qū)和第Ⅳ酶區(qū)是龍眼POD的弱性區(qū)，所產(chǎn)生的酶帶活性較弱。第二條、第三條酶帶(遷移率分別為0.220、0.253)是龍眼樣品的特征譜帶。POD同工酶聚類分析結(jié)果把95份龍眼遺傳資源分為2個(gè)品種類群并細(xì)分為7組。 三、龍眼葉片DNA提取方法的建立。針對龍眼葉片富含單寧和多糖的特性，采用兩種提取DNA的方法：一種把Tris替代Tris-HCl的改良CTAB法；另一種為加溶解液先除掉可溶性多糖再加入裂解液的改

5、良CTAB法。兩種方法都能有效地克服多糖等物質(zhì)的干擾，更加簡便地從龍眼葉片提取較高質(zhì)量和產(chǎn)量的DNA。 四、龍眼RAPD-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化。在參考一般RAPD分析的反應(yīng)程序的基礎(chǔ)上，經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)，確立適宜的PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5min，94℃1min，38℃40s，72℃2min，共45個(gè)循環(huán)，最后置4℃保溫。優(yōu)化的龍眼RAPD-PCR反應(yīng)體系為：25μL反應(yīng)總體積中，包括龍眼模板DNA25ng，Mg2+濃度為1.5

6、mmol/L，2.5mmol/μLdNTP2μL，10×Buffer2.5μL，引物2.0×103nmoL-1，采用的Taq酶濃度為1.25U。 五、龍眼遺傳資源的RAPD分析。選用上海Sangon公司的200條隨機(jī)引物，篩選出多態(tài)性明顯的18條引物，對龍眼95份遺傳資源進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)引物均能夠產(chǎn)生清楚的條帶。共產(chǎn)生197條擴(kuò)增帶，平均每個(gè)引物產(chǎn)生的條帶為10.944；不同引物獲得的擴(kuò)增帶7～15不等，其中最多的S207，

7、為15條；最少的是S234產(chǎn)生7條擴(kuò)增帶；DNA擴(kuò)增帶的多態(tài)性為100％，這表明95份材料的遺傳多樣性高。根據(jù)ED法計(jì)算各樣品間的遺傳相似系數(shù)，采用UPGMA法進(jìn)行龍眼品種或種類分析，建立親緣關(guān)系聚類樹狀圖。以結(jié)合距離D=0.80為界，本研究可以將95份龍眼遺傳資源區(qū)分為中國龍眼和泰國龍眼2個(gè)品種類群。以D=0.4為界時(shí)，把供試的89份中國龍眼遺傳資源分為11組。 六、苗木鑒定和品種的區(qū)分。采用POD同工酶分析和RAPD分析相結(jié)

8、合技術(shù)，可以判定烏龍種與烏龍嶺、鳳梨穗與鳳梨味其遺傳距離較遠(yuǎn)，應(yīng)屬于不同品種類型，而虎眼與福眼則為同物異名。表明該技術(shù)可以很好的解決龍眼苗木鑒定、同物異名、同名異物辨別的難題。 七、13個(gè)東壁龍眼株系的分析。采用Sangon22條長度為10個(gè)堿基的引物對13個(gè)東壁龍眼的優(yōu)良株系進(jìn)行RAPD分析。13個(gè)樣品擴(kuò)增出124條擴(kuò)增帶，不同引物獲得的擴(kuò)增帶3～9條不等，S299最少，只有3條，S60最多，有9條，平均為5.64條。而POD

9、同工酶電泳圖譜上13個(gè)樣品基本一致。通過POD同工酶和RAPD分析結(jié)果可以知道13個(gè)東壁龍眼在遺傳上有著非常高的相似系數(shù)，證明了他們之間在遺傳上保持著較高的穩(wěn)定性；但是RAPD分析結(jié)果表明，隨著環(huán)境和時(shí)間的變化，其中6個(gè)株系產(chǎn)生了基因變異。研究結(jié)果還進(jìn)一步證明，RAPD分子標(biāo)記優(yōu)于POD同工酶分析，對資源的遺傳分析更加科學(xué)。本試驗(yàn)研究確立和優(yōu)化了龍眼同工酶的反應(yīng)體系，為將來開展龍眼及其它亞熱帶果樹同工酶的研究工作提供了技術(shù)參考；RAPD