1、目前，已建立的小鼠ES細(xì)胞系大多來源于129、C57BL/6J和BALB/C品系的小鼠，昆明小鼠作為我國科研工作中常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其建系的報(bào)道較少，因此建立昆明小鼠胚胎干細(xì)胞系對(duì)我國深入而便利地開展ES細(xì)胞以及其它生命科學(xué)領(lǐng)域的研究具有重要意義。SC1是一種小分子化學(xué)物，可以雙重抑制Ras-GAP和ERK1，維持胚胎干細(xì)胞未分化狀態(tài)。另外，近幾年，已有多篇關(guān)于胚胎干細(xì)胞(Embryonicstemcells，ES細(xì)胞)在體外誘導(dǎo)條件下分

2、化為原始生殖細(xì)胞(Primordialgermcells，PGCs)，并進(jìn)一步生成成熟配子的報(bào)道，但ES細(xì)胞向生殖細(xì)胞的誘導(dǎo)效率很低。本研究用昆明小鼠胚胎作為試驗(yàn)對(duì)象，比較了不同培養(yǎng)條件對(duì)昆明小鼠ES細(xì)胞分離培養(yǎng)的影響，研究了小分子化學(xué)物(Pluripotin，SC1)對(duì)昆明小鼠ES細(xì)胞未分化狀態(tài)的維持作用，并用視黃酸(Retinoicacid，RA)對(duì)分離到的ES細(xì)胞向PGCs誘導(dǎo)分化進(jìn)行了初步研究，為昆明小鼠ES細(xì)胞建系及向生殖細(xì)胞

3、的體外分化研究提供參考。
　　 1.利用MTT法檢測絲裂霉素C(10μg/mL)處理不同時(shí)間后小鼠胎兒成纖維細(xì)胞(Mouseembryonicfibroblast，MEF)活力變化情況。結(jié)果表明，以3代以內(nèi)MEF制備飼養(yǎng)層，用濃度為10μg/mL的絲裂霉素C處理2～2.5h，MEF活力最穩(wěn)定，可以維持小鼠胎兒成纖維細(xì)胞7d以上不增殖也不死亡，是制備飼養(yǎng)層的適宜條件。
　　 2.將見栓后3.5～4d的胚胎分別接種于密度為1

4、×104、1×105、1×106/mL的飼養(yǎng)層上，比較胚胎在不同密度飼養(yǎng)層上貼壁、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(Innercellmass，ICM)集落形成及ES細(xì)胞的克隆生長情況。同時(shí)，以無血清培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，研究胚胎發(fā)育階段和培養(yǎng)液中添加不同生長因子對(duì)昆明小鼠ES細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示，胚胎在密度為1×105/mL的飼養(yǎng)層上，F(xiàn)1代和F2代ES細(xì)胞集落出現(xiàn)率均顯著高于其他2組(P<0.05)。囊胚的F2代ES細(xì)胞克隆出現(xiàn)率顯著高于桑葚胚(P<0.

5、05)，培養(yǎng)液中同時(shí)添加干細(xì)胞因子(Stemcellfactor，SCF)和胰島素的胚胎貼壁率及F1、F2代ES細(xì)胞集落出現(xiàn)率顯著高于其他2組(P<0.05)。對(duì)分離的ES細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)觀察、堿性磷酸酶(Alkalinephosphatase，AKP)染色，免疫熒光染色檢測小鼠ES細(xì)胞全能性特異標(biāo)志物的表達(dá)，證實(shí)所分離的ES細(xì)胞符合小鼠ES的一系列特征。由此認(rèn)為，發(fā)育至囊胚的胚胎在飼養(yǎng)層密度為1×105/mL上，培養(yǎng)液中同時(shí)添加胰島素和S

6、CF適合昆明小鼠ES細(xì)胞的分離培養(yǎng)。
　　 3.比較了在含血清替代品(Knockoutserumreplacement，KSR)的高糖DMEM培養(yǎng)液中(H-DMEM)分別添加SC1和白血病抑制因子(Leukemiainhibitoryfactor，LIF)對(duì)昆明小鼠ES細(xì)胞未分化狀態(tài)的維持作用，并探討了SC1在培養(yǎng)液中的最佳濃度。以MEF為飼養(yǎng)層，以含LIF的無血清胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液為對(duì)照，分別用濃度為300nM、1μM、3μM的

7、SC1代替LIF對(duì)昆明小鼠胚胎進(jìn)行分離培養(yǎng)。結(jié)果顯示，胚胎在添加3μmSCl的培養(yǎng)液中ICM集落形成率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，形成的ES集落與對(duì)照組形態(tài)差異不明顯，最高傳至第7代，并且在無飼養(yǎng)層條件下可以傳至第6代而保持未分化狀態(tài)。不同濃度SC1培養(yǎng)液中，胚胎在SC1濃度為300nM組的F2代ES細(xì)胞集落出現(xiàn)率顯著高于1μM和3μM組(P<0.05)，所分離的ES細(xì)胞AKP染色呈陽性，Oct4、Nanog、Sox2的免疫熒光染色

8、均顯陽性，具有ES細(xì)胞的特點(diǎn)。這一結(jié)果表明無血清培養(yǎng)液中SC1可以替代LIF用于昆明小鼠ES細(xì)胞未分化狀態(tài)的維持，并且可以在無飼養(yǎng)層條件下進(jìn)行昆明小鼠ES細(xì)胞的培養(yǎng)。
　　 4.探討了RA誘導(dǎo)昆明小鼠ES細(xì)胞向PGCs分化的能力及適宜濃度。采用懸滴培養(yǎng)法使分離到的第3代ES細(xì)胞形成類胚體(Embryonicbodys，EBs)，將第3d形成的EBs，接在鋪有0.1％明膠的48孔板中，5個(gè)EB/孔，分別用濃度為0.2μM、1μM、